可溶性澱粉合成酶(SSS）測試盒

可溶性澱粉合成酶(SSS）測試盒

 微量法 100管/96樣

正式測定前務必取2-3個(ge) 預期差異較大的樣本做預測定

測定意義(yi)

SSS（EC 2.4.1.21）通常以遊離態存在於(yu) 質體(ti) 基質中，催化澱粉鏈延長，主要負責支鏈澱粉的合成。

測定原理

SSS催化ADPG與(yu) 澱粉引物(葡聚糖)反應，將葡萄糖分子轉移到澱粉引物上，同時生成ADP，在反應體(ti) 係中添加的丙酮酸激酶、己糖激酶和6-磷酸葡萄糖脫氫酶依次催化NADP+還原為(wei) NADPH，NADPH生成量與(yu) 前一步反應中ADP生成量呈正比，340nm下測定NADPH增加量即可計算SSS活性。

需自備的的儀(yi) 器和用品

紫外分光光度計/酶標儀(yi) 、水浴鍋、台式離心機、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配製

提取液：液體(ti) 100mL×1瓶，4℃保存；

試劑一：40mL×1瓶，4℃保存；

試劑二：粉劑×1瓶，4℃保存；臨(lin) 用前加入14mL試劑一充分混勻備用；用不完的試劑分裝後-20℃保存，禁止反複凍融；

試劑三：粉劑×1瓶，4℃保存；臨(lin) 用前加入8mL試劑一充分混勻備用；用不完的試劑分裝後-20℃保存，禁止反複凍融；

試劑四：粉劑×1瓶，4℃保存；臨(lin) 用前加入10mL試劑一充分混勻備用；用不完的試劑分裝後-20℃保存，禁止反複凍融；

試劑五：液體(ti) ×1支，-20℃保存；臨(lin) 用前加入500μL蒸餾水，充分溶解備用；用不完的試劑分裝後-20℃保存，禁止反複凍融；

試劑六：粉劑×1支，-20℃保存；臨(lin) 用前加入500μL蒸餾水，充分溶解備用；用不完的試劑分裝後-20℃保存，禁止反複凍融；

粗酶液製備 

按照組織質量（g）：提取液體(ti) 積(mL)為(wei) 1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進行冰浴勻漿。10000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

測定步驟

1、分光光度計或酶標儀(yi) 預熱30min以上，調節波長至340nm，蒸餾水調零。

2、在EP管中按順序加入下列試劑

混勻，30℃保溫20 min，置沸水浴中1 min（蓋緊，防止水分散失），冰浴冷卻

混勻，30℃保溫30 min，置沸水浴中1 min（蓋緊，防止水分散失），冰浴冷卻，10000g 4℃離心10min，取上清液（如果一次性測定樣本較多，可以將試劑四、五和六按比例配成混合液）

混勻後立即340 nm波長下記錄初始吸光度A1和 2min後的吸光度A2，計算ΔA=A2-A1。

注意：試劑二如有沉澱，加入之前要使之充分溶解混勻。

SSS活性計算

a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下：

1、按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義(yi) ：每mg組織蛋白每分鍾催化產(chan) 生1nmol NADPH定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

SSS（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(Cpr×V樣) ÷T×稀釋倍數

                =529×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質濃度。

2、按照樣本鮮重計算

單位的定義(yi) ：每g組織每分鍾催化產(chan) 生1nmol NADPH定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

SSS活性（nmol/min /g 鮮重）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷（V樣÷V樣總×W）÷T×稀釋倍數

                    =529×ΔA÷W

V 反總：反應體(ti) 係總體(ti) 積，2.6×10-4 L；ε：NADPH摩爾消光係數，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體(ti) 積，0.075 mL；V樣總：加入提取液體(ti) 積，1 mL；T：反應時間，2 min；稀釋倍數：1.9；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量。

b.使用96孔板測定的計算公式如下：

1、按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義(yi) ：每mg組織蛋白每分鍾催化產(chan) 生1nmol NADPH定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

SSS（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(Cpr×V樣) ÷T×稀釋倍數

 =1059×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質濃度。

2、按照樣本鮮重計算

單位的定義(yi) ：每g組織每分鍾催化產(chan) 生1nmol NADPH定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

SSS活性（nmol/min/g 鮮重）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷（V樣÷V樣總×W）÷T×稀釋倍數 =1059×ΔA÷W

V 反總：反應體(ti) 係總體(ti) 積，2.6×10-4 L；ε：NADPH摩爾消光係數，6.22×103 L / mol /cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體(ti) 積，0.075 mL；V樣總：加入提取液體(ti) 積，1 mL；T：反應時間，2 min；稀釋倍數：1.9；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量。

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