二胺氧化酶(DAO)測試盒

二胺氧化酶(DAO)測試盒

微量法100T/48S

注意：正式測定之前選擇2-3個(ge) 預期差異大的樣本做預測定。

測定意義(yi) ：

DAO(EC1.4.3.6)廣泛存在於(yu) 動物（腸粘膜、肺、肝髒、腎髒等）、植物和微生物中。催化多胺氧化為(wei) 醛，其活性與(yu) 核酸和蛋白合成密切相關(guan) ，能夠反映腸道機械屏障的完整性和受損傷(shang) 程度。

測定原理：

DAO催化屍胺產(chan) 生醛和過氧化氫，外源添加過量的辣根過氧化物酶，催化過氧化氫氧化鄰聯茴香胺生成氧化型鄰聯茴香胺，在460nm處有特征吸收峰，通過測定該波長吸光度增加速率，計算DAO活性。

自備實驗用品及儀(yi) 器：

天平、低溫離心機、可見分光光度計/酶標儀(yi) 、微量石英比色皿/96孔板、蒸餾水。

試劑組成和配製：

提取液：液體(ti) 120mL×1瓶，4℃保存。

試劑一：液體(ti) 0.3mL×1支，4℃保存。

試劑二：液體(ti) 2.5mL×1瓶，4℃保存。

試劑三：液體(ti) 1.2mL×1管，4℃保存。

粗酶液提取：

組織：按照組織質量（g）：提取液體(ti) 積(mL)為(wei) 1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液）進行冰浴勻漿，然後10000g，4℃離心20min，取上清，置冰上待測。

細菌、真菌：按照細胞數量（104個(ge) ）：提取液體(ti) 積（mL）為(wei) 500~1000：1的比例（建議500萬(wan) 細胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然後10000g，4℃，離心10min，取上清置於(yu) 冰上待測。

血清等液體(ti) ：直接測定。

測定操作表：

1、分光光度計/酶標儀(yi) 預熱30min，調節波長至460nm，蒸餾水調零。

2、操作表

酶活性計算公式：

a. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下

（1）按樣本蛋白濃度計算：

酶活性定義(yi) ：在pH7.2，溫度為(wei) 37℃條件下，每毫克組織蛋白每分鍾催化產(chan) 生1nmol H2O2所需的酶量為(wei) 一個(ge) 酶活力單位（U）。

DAO活性（nmol/min/mg prot）= ×V反總÷（V樣×Cpr）÷T= 18×A460÷Cpr

（2）按樣本質量計算：

酶活性定義(yi) ：在pH7.2，溫度為(wei) 37℃條件下，每克組織每分鍾催化產(chan) 生1nmol H2O2所需的酶量定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

DAO活性（nmol/min/g 鮮重）= ×V反總÷（V樣÷V樣總×W）÷T= 18×A460÷W

（3）按細胞數量計算：

酶活性定義(yi) ：在pH7.2，溫度為(wei) 37℃條件下，每104個(ge) 細胞每分鍾催化產(chan) 生1nmol H2O2所需的酶量定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

DAO活性（nmol/min/104cell）= ×V反總÷（V樣÷V樣總×細胞數量）÷T= 18×A460÷細胞數量

(4) 按液體(ti) 體(ti) 積計算

酶活性定義(yi) ：在pH7.2，溫度為(wei) 37℃條件下，每毫升血清每分鍾催化產(chan) 生1nmol H2O2所需的酶量定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

DAO活性（nmol/min/mL）= ×V反總÷V樣÷T= 18×A460

ε：氧化型鄰聯茴香胺毫摩爾消光係數：7.5 L/mmol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V反總：反應總體(ti) 積，0.2mL；V樣：反應中樣本體(ti) 積，0.05mL；V樣總：加入提取液體(ti) 積，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；T：反應時間，30min

b. 用96孔板測定的計算公式如下

（1）按樣本蛋白濃度計算：

酶活性定義(yi) ：在pH7.2，溫度為(wei) 37℃條件下，每毫克組織蛋白每分鍾催化產(chan) 生1nmol H2O2所需的酶量為(wei) 一個(ge) 酶活力單位（U）。

DAO活性（nmol/min/mg prot）= ×V反總÷（V樣×Cpr）÷T= 36×A460÷Cpr

（2）按樣本質量計算：

酶活性定義(yi) ：在pH7.2，溫度為(wei) 37℃條件下，每克組織每分鍾催化產(chan) 生1nmol H2O2所需的酶量定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

DAO活性（nmol/min/g 鮮重）= ×V反總÷（V樣÷V樣總×W）÷T= 36×A460÷W

（3）按細胞數量計算：

酶活性定義(yi) ：在pH7.2，溫度為(wei) 37℃條件下，每104個(ge) 細胞每分鍾催化產(chan) 生1nmol H2O2所需的酶量定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

DAO活性（nmol/min/104cell）= ×V反總÷（V樣÷V樣總×細胞數量）÷T= 36×A460÷細胞數量

(4) 按液體(ti) 體(ti) 積計算

酶活性定義(yi) ：在pH7.2，溫度為(wei) 37℃條件下，每毫升血清每分鍾催化產(chan) 生1nmol H2O2所需的酶量定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

DAO活性（nmol/min/mL）= ×V反總÷V樣÷T= 36×A460

ε：氧化型鄰聯茴香胺毫摩爾消光係數：7.5 L /mmol/cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V反總：反應總體(ti) 積，0.2mL；V樣：反應中樣本體(ti) 積，0.05mL；V樣總：加入提取液體(ti) 積，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；T：反應時間，30min

注意事項：

1、如果OD值小於(yu) 0.01，適當加大提取用樣本量；OD值大於(yu) 0.8，粗酶液可適當稀釋，或者減少提取用樣本量。

2、樣品蛋白質含量需要另外測定。

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