乳酸脫氫酶（LDH）測試盒

乳酸脫氫酶（LDH）測試盒

正式測定前務必取2-3個(ge) 預期差異較大的樣本做預測定

測定意義(yi) ：

LDH（EC 1.1.1.27）廣泛存在於(yu) 動物、植物、微生物和培養(yang) 細胞中，是糖酵解途徑的末端酶，催化丙酮酸與(yu) 乳酸之間的可逆反應，伴隨著NAD+/NADH之間互變。

測定原理：

LDH催化NAD+氧化乳酸生成丙酮酸，丙酮酸進一步與(yu) 2, 4 - 二硝基苯肼作用生成丙酮酸二硝基苯腙，在堿性溶液中顯棕紅色，顏色深淺與(yu) 丙酮酸濃度成正比。

需自備的儀(yi) 器和用品：

可見分光光度計/酶標儀(yi) 、恒溫水浴鍋、台式離心機、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配製：

提取液：60mL×1瓶， 4℃保存；

試劑一：液體(ti) 5 mL×1瓶， 4℃保存； 

試劑二：粉劑×1支，-20℃保存，用時加入10μL試劑五和1.3 mL蒸餾水充分溶解備用，用不完的試劑分裝後-20℃保存，禁止反複凍融；

試劑三：液體(ti) 5 mL×1瓶，4℃保存； 

試劑四：液體(ti) 20 mL×1瓶，4℃保存； 

試劑五：液體(ti) 100μL×1支，4℃保存；

樣品測定的準備：

1、細菌、細胞或組織樣品的製備：

細菌或培養(yang) 細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nei) ，離心後棄上清；按照細菌或細胞數量（104個(ge) ）：提取液體(ti) 積（mL）為(wei) 1000~5000：1的比例（建議2000萬(wan) 細菌或細胞加入1mL提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重複30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

組織：按照組織質量（g）：提取液體(ti) 積(mL)為(wei) 1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2、血清（漿）樣品：直接檢測。

測定步驟：

1. 分光光度計或酶標儀(yi) 預熱30min以上，調節波長至450nm，蒸餾水調零。

2、樣本測定（在EP管中加入下列試劑）

充分混勻，37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）準確水浴15min

充分混勻，37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）準確水浴15min

充分混勻，室溫靜置15min， 450 nm下測定吸光度，計算ΔA=A測定管-A對照管。每個(ge) 測定管需要設一個(ge) 對照管。

LDH活力單位的計算：

a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1、標準條件下測定的回歸曲線， y = 0.9108x+0.0037   (x為(wei) 標準品濃度，umol/mL；y為(wei) ΔA)。

2、血清（漿）LDH活力的計算

單位的定義(yi) ：每mL血清（漿）每分鍾催化產(chan) 生1nmol丙酮酸定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

LDH（nmol/min/mL）=（ΔA-0.0037）÷0.9108÷T×103=73.2×ΔA

3、細胞、細菌和組織中LDH活力的計算

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義(yi) ：每mg組織蛋白每分鍾催化產(chan) 生1 nmol丙酮酸定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

LDH（nmol/min/mg prot）=[（ΔA-0.0037）÷0.9108×V1]÷(V1×Cpr)÷T×103 =73.2×ΔA÷Cpr

需要另外測定，建議使用本公司BCA蛋白質含量測定試劑盒。

（2） 按樣本鮮重計算：

單位的定義(yi) ：每g組織每分鍾催化產(chan) 生1nmol丙酮酸定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

LDH（nmol/min/g鮮重）=[（ΔA-0.0037）÷0.9108×V1]÷(W×V1÷V2)÷T×103 =73.2×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位的定義(yi) ：每1萬(wan) 個(ge) 細菌或細胞每分鍾催化產(chan) 生1nmol丙酮酸定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

LDH（nmol/min/104 cell）= [（ΔA-0.0037）÷0.9108×V1]÷(2000×V1÷V2)÷T×103 =0.037×ΔA

V1：加入反應體(ti) 係中樣本體(ti) 積，0.01mL；V2：加入提取液體(ti) 積，1 mL；T：反應時間，15 min；Cpr：蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；2000：細胞或細菌總數，2000萬(wan) ；103：1umol/mL=103 nmol/mL。

b.使用96孔板測定的計算公式如下：

1、標準條件下測定的回歸曲線， y = 0.4554x+0.0037   (x為(wei) 標準品濃度，umol/mL；y為(wei) ΔA)。

2、血清（漿）LDH活力的計算

單位的定義(yi) ：每mL血清（漿）每分鍾催化產(chan) 生1nmol丙酮酸定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

LDH（nmol/min/mL）=（ΔA-0.0037）÷0.4554÷T×103=146.4×（ΔA-0.0037）

3、細胞、細菌和組織中LDH活力的計算

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義(yi) ：每mg組織蛋白每分鍾催化產(chan) 生1 nmol丙酮酸定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

LDH（nmol/min/mg prot）=[（ΔA-0.0037）÷0.4554×V1]÷(V1×Cpr)÷T×103 =146.4×（ΔA-0.0037）÷Cpr

需要另外測定，建議使用本公司BCA蛋白質含量測定試劑盒。

（2） 按樣本鮮重計算：

單位的定義(yi) ：每g組織每分鍾催化產(chan) 生1nmol丙酮酸定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

LDH（nmol/min/g鮮重）=[（ΔA-0.0037）÷0.4554×V1]÷(W×V1÷V2)÷T×103 =146.4×（ΔA-0.0037）÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位的定義(yi) ：每1萬(wan) 個(ge) 細菌或細胞每分鍾催化產(chan) 生1nmol丙酮酸定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

LDH（nmol/min/104 cell）= [（ΔA-0.0037）÷0.4554×V1]÷(2000×V1÷V2)÷T×103 =0.073×（ΔA-0.0037）

V1：加入反應體(ti) 係中樣本體(ti) 積，0.01mL；V2：加入提取液體(ti) 積，1 mL；T：反應時間，15 min；Cpr：蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；2000：細胞或細菌總數，2000萬(wan) ；103：1umol/mL=103 nmol/mL。

1. 標準曲線線性範圍為(wei) ：0.1 umol/mL -2 umol/mL。

2. ΔA線性範圍為(wei) ：0.01 -1。

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