乙醇脫氫酶（ADH）測試盒

乙醇脫氫酶（ADH）測試盒

注意：正式測定之前選擇2-3個(ge) 預期差異大的樣本做預測定。

測定意義(yi) ：

ADH是生物體(ti) 內(nei) 短鏈醇代謝的關(guan) 鍵酶，催化乙醇與(yu) 乙醛可逆轉換，在很多生理過程中起著重要作用。哺乳動物ADH主要在肝髒生成，肝髒損傷(shang) 導致ADH釋放到血清中。血清ADH活性高低反映了肝功能是否異常。

測定原理：

ADH催化NADH還原乙醛生成乙醇和NAD+，NADH在340nm處有吸收峰，而NAD+沒有；測定340nm 吸光度下降速率，來計算ADH活性。

自備儀(yi) 器和用品：

研缽、冰、低溫離心機、紫外分光光度計/酶標儀(yi) 、微量石英比色皿/96孔板、可調式移液器和蒸餾水。

試劑組成和配製：

試劑一：液體(ti) ×1瓶，室溫保存。

試劑二：液體(ti) ×1瓶，4℃保存。               

試劑三：粉劑×2瓶，－20℃保存，臨(lin) 用前每瓶加入9mL試劑二，現配現用。

試劑四：液體(ti) ×1支，4℃保存。

粗酶液提取：

1. 組織：按照組織質量（g）：試劑一體(ti) 積(mL)為(wei) 1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進行冰浴勻漿。16000g，4℃離心20min，取上清置冰上待測。

2. 細菌、真菌：按照細胞數量（104個(ge) ）：試劑一體(ti) 積（mL）為(wei) 500~1000：1的比例（建議500萬(wan) 細胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；16000g， 4℃離心20min，取上清液置冰上待測。

3、血清等液體(ti) ：直接測定。

ADH測定操作：

1. 分光光度計/酶標儀(yi) 預熱30 min，調節波長到340 nm，蒸餾水調零。

2. 試劑三在25℃水浴中保溫30 min。

3. 在微量石英比色皿/96孔板中依次加入20μL樣本上清液、160μL試劑三和20μL試劑四，迅速混勻後於(yu) 340nm測定吸光值變化，分別記錄15s和75s時吸光值，分別記為(wei) A1和A2。△A測定管=A1-A2。

計算公式：

a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下

（1）按照蛋白濃度計算

活性單位定義(yi) ：25℃中每毫克蛋白每分鍾氧化1nmol NADH 為(wei) 1個(ge) 酶活單位。

ADH (nmol/min/mg prot) =(△A÷ε÷d×V反總×109)÷(Cpr×V樣)÷T

=1608×△A ÷Cpr

（2）按照樣本質量計算

活性單位定義(yi) ：25℃中每克組織每分鍾氧化1nmol NADH 為(wei) 1個(ge) 酶活單位。

ADH (nmol/min/g 鮮重) =(△A÷ε÷d×V反總×109)÷(W×V樣÷V樣總)÷T

=1608×△A ÷W

（3）按細胞數量計算

活性單位定義(yi) ：25℃中每104個(ge) 細胞每分鍾氧化1nmol NADH 為(wei) 1個(ge) 酶活單位。

ADH (nmol/min/104cell) = (△A÷ε÷d×V反總×109) ÷(細胞數量×V樣÷V樣總)÷T

=1608×△A ÷細胞數量

（4）按液體(ti) 體(ti) 積計算

活性單位定義(yi) ：25℃中每毫升血清每分鍾氧化1nmol NADH 為(wei) 1個(ge) 酶活單位。

ADH (nmol/min/mL) =(△A÷ε÷d×V反總×109) ÷V樣÷T

=1608×△A

ε：NADH摩爾消光係數，6.22×103L/mol/cm；d：比色皿光徑，1 cm；V反總：反應體(ti) 係總體(ti) 積，200μL=2×10-4 L；Cpr：上清液蛋白質濃度，mg/mL；W ：樣品質量；V樣：加入反應體(ti) 係中上清液體(ti) 積，20μL=0.02 mL；V樣總：提取液體(ti) 積，1 mL；T：反應時間，1min。

b.使用96孔板測定的計算公式如下

（1）按照蛋白濃度計算

活性單位定義(yi) ：25℃中每毫克蛋白每分鍾氧化1nmol NADH 為(wei) 1個(ge) 酶活單位。

ADH (nmol/min/mg prot) =(△A÷ε÷d×V反總×109) ÷(Cpr×V樣)÷T

=3215×△A÷Cpr

（2）按照樣本質量計算

活性單位定義(yi) ：25℃中每克組織每分鍾氧化1nmol NADH 為(wei) 1個(ge) 酶活單位。

ADH (nmol/min/g 鮮重) =(△A÷ε÷d×V反總×109) ÷(W×V樣÷V樣總)÷T

=3215×△A÷W

（3）按細胞數量計算

活性單位定義(yi) ：25℃中每104個(ge) 細胞每分鍾氧化1nmol NADH 為(wei) 1個(ge) 酶活單位。

ADH (nmol/min/104cell) =(△A÷ε÷d×V反總×109) ÷(細胞數量×V樣÷V樣總)÷T

=3215×△A÷細胞數量

（4）按液體(ti) 體(ti) 積計算

活性單位定義(yi) ：25℃中每毫升血清每分鍾氧化1nmol NADH 為(wei) 1個(ge) 酶活單位。

ADH (nmol/min/mL) =(△A÷ε÷d×V反總×109) ÷V樣÷T

=3215×△A

ε：NADH摩爾消光係數，6.22×103L/mol/cm；d：96孔板光徑，0.5 cm；V反總：反應體(ti) 係總體(ti) 積，200μL=2×10-4 L；Cpr：上清液蛋白質濃度，mg/mL；W ：樣品質量；V樣：加入反應體(ti) 係中上清液體(ti) 積，20μL=0.02 mL；V樣總：提取液體(ti) 積，1 mL；T：反應時間，1min。

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