丙酮酸脫羧酶（PDC）測試盒

丙酮酸脫羧酶（PDC）測試盒

注意：正式測定之前選擇2-3個(ge) 預期差異大的樣本做預測定。

測定意義(yi) ：

PDC主要存在於(yu) 酵母中，是乙醇發酵的關(guan) 鍵酶之一，催化丙酮酸脫羧生成乙醛。

測定原理：

PDC催化丙酮酸脫羧生成乙醛，添加乙醇脫氫酶（ADH）來進一步催化 NADH還原乙醛生成乙醇和NAD+；NADH在340 nm有吸收峰，而NAD+沒有；通過測定340 nm光吸收下降速率，來計算PDC活性。

自備儀(yi) 器和用品：

研缽、冰、台式離心機、紫外分光光度計/酶標儀(yi) 、微量石英比色皿/96孔板、可調式移液槍和蒸餾水。

試劑組成和配製：

試劑一：液體(ti) 100mL×1瓶，4℃保存。

試劑二：液體(ti) 18mL×1瓶，4℃保存。

試劑三：液體(ti) 2.5mL×1瓶，4℃保存。

試劑四：粉劑×1支，﹣20℃保存。

試劑五：液體(ti) 30μL×1瓶，﹣20℃保存。

混合試劑：臨(lin) 用前配製，將試劑四和試劑五轉移至試劑三中充分溶解待用，用不完的試劑分裝後-20℃保存，禁止反複凍融。

試劑六：液體(ti) 2mL×1管，4℃保存。

粗酶液提取：

1、細菌或細胞處理：收集細菌或細胞到離心管內(nei) ，離心後棄上清；按照每200萬(wan) 細菌或細胞加入400μL提取液，超聲波破碎細菌或細胞（功率200W，工作3s，間歇10s，工作35次），16000g 4℃離心20min，取上清，置冰上待測。

2、組織處理：按照組織質量（g）：試劑一體(ti) 積(mL)為(wei) 1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進行冰浴勻漿，16000g 4℃離心20min，取上清，置冰上待測。

3、血清（漿）樣品：直接檢測。

PDC測定操作：

1. 分光光度計/酶標儀(yi) 預熱30min，調節波長到340 nm，蒸餾水調零。

2. 試劑二置於(yu) 25℃水浴中預熱30min。

3. 空白管：依次在微量石英比色皿/96孔板中加入20μL蒸餾水、20μL混合試劑、140μL試劑二和20μL試劑六，迅速混勻後於(yu) 340nm比色，記錄15s和75s的吸光值，分別記為(wei) A1和A2。

4. 測定管：依次在微量石英比色皿/96孔板中加入20μL上清液、20μL混合試劑、140μL試劑二和20μL試劑六，迅速混勻後於(yu) 340nm比色，記錄15s和75s的吸光值，分別記為(wei) A3和A4。

注意：空白管隻需測定一次。

PDC活性計算：

a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下

（1）按照蛋白濃度計算

活性單位定義(yi) ：25℃中，每毫克蛋白每分鍾催化1nmol NADH 氧化為(wei) 1個(ge) 酶活單位。

PDC (nmol/min/mg prot) =÷(Cpr×V樣) ÷T

=1608×[(A3－A4)－(A1-A2)]÷Cpr

（2）按照樣本質量計算

活性單位定義(yi) ：25℃中，每克組織每分鍾催化1nmol NADH 氧化為(wei) 1個(ge) 酶活單位。

PDC (nmol/min /g 鮮重) =÷(W×V樣÷V樣總) ÷T

=1608×[(A3－A4)－(A1-A2)]÷W

（3）按細胞數量計算

活性單位定義(yi) ：25℃中，每104個(ge) 細胞每分鍾催化1nmol NADH 氧化為(wei) 1個(ge) 酶活單位。

PDC (nmol/min/104cell) =÷(細胞數量×V樣÷V樣總) ÷T

=1608×[(A3－A4)－(A1-A2)]÷細胞數量

（4）按血清（漿）體(ti) 積計算

活性單位定義(yi) ：25℃中，每毫升血清（漿）每分鍾催化1nmol NADH 氧化為(wei) 1個(ge) 酶活單位。PDC (nmol/min /mL) =÷V樣÷T

=1608×[(A3－A4)－(A1-A2)]

ε：NADH摩爾消光係數，6.22×103L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V總：反應體(ti) 係總體(ti) 積，0.2mL=2×10-4 L，V樣：加入反應體(ti) 係中上清液體(ti) 積，0.02mL；V樣總：提取液體(ti) 積，1 mL；Cpr：蛋白濃度（mg/mL），需要另外測定，建議使用本公司BCA蛋白質含量試劑盒；W ：樣品質量； T：反應時間，1 min。

b.使用96孔板測定的計算公式如下

（1）按照蛋白濃度計算

活性單位定義(yi) ：25℃中，每毫克蛋白每分鍾催化1nmol NADH 氧化為(wei) 1個(ge) 酶活單位。

PDC (nmol/min/mg prot) =÷(Cpr×V樣) ÷T

=3215×[(A3－A4)－(A1-A2)]÷Cpr

（2）按照樣本質量計算

活性單位定義(yi) ：25℃中，每克組織每分鍾催化1nmol NADH 氧化為(wei) 1個(ge) 酶活單位。

PDC (nmol/min /g 鮮重) =÷(W×V樣÷V樣總) ÷T

=3215×[(A3－A4)－(A1-A2)]÷W

（3）按細胞數量計算

活性單位定義(yi) ：25℃中，每104個(ge) 細胞每分鍾催化1nmol NADH 氧化為(wei) 1個(ge) 酶活單位。

PDC (nmol/min/104cell) =÷(細胞數量×V樣÷V樣總) ÷T

=3215×[(A3－A4)－(A1-A2)]÷細胞數量

（4）按血清（漿）體(ti) 積計算

活性單位定義(yi) ：25℃中，每毫升血清（漿）每分鍾催化1nmol NADH 氧化為(wei) 1個(ge) 酶活單位。PDC (nmol/min /mL) =÷V樣÷T

=3215×[(A3－A4)－(A1-A2)]

ε：NADH摩爾消光係數，6.22×103L/mol/cm；d：96孔板光徑，0.5 cm；V總：反應體(ti) 係總體(ti) 積，0.2mL=2×10-4 L，V樣：加入反應體(ti) 係中上清液體(ti) 積，0.02mL；V樣總：提取液體(ti) 積，1 mL；Cpr：蛋白濃度（mg/mL），需要另外測定，建議使用本公司BCA蛋白質含量試劑盒；W ：樣品質量； T：反應時間，1 min。

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