丙酮酸激酶（PK）測試盒

丙酮酸激酶（PK）測試盒

正式測定前務必取2-3個(ge) 預期差異較大的樣本做預測定

測定意義(yi)

PK（EC 2.7.1.40）廣泛存在於(yu) 動物、植物、微生物和培養(yang) 細胞中，催化糖酵解過程中的最後一步反應，是糖酵解過程中的主要限速酶之一，也是產(chan) 生ATP的關(guan) 鍵酶之一，因此測定PK活性具有重要意義(yi) 。

測定原理

PK催化磷酸烯醇式丙酮酸和ADP生成ATP和丙酮酸，乳酸脫氫酶進一步催化NADH和丙酮酸生成乳酸和NAD+，在340nm下測定NADH下降速率，即可反映PK活性。

需自備的儀(yi) 器和用品

紫外分光光度計/酶標儀(yi) 、台式離心機、水浴鍋、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水

試劑的組成和配製

提取液：100mL×1瓶，4℃保存;

試劑一：液體(ti) 20mL×1瓶，4℃保存；； 

試劑二：粉劑×2瓶，-20℃保存； 

試劑三：液體(ti) 10μL×2支，4℃保存； 

樣本的前處理

1、細菌或培養(yang) 細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nei) ，離心後棄上清；按照細菌或細胞數量（104個(ge) ）：提取液體(ti) 積（mL）為(wei) 500~1000：1的比例（建議500萬(wan) 細菌或細胞加入1mL提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重複30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2、組織：按照組織質量（g）：提取液體(ti) 積(mL)為(wei) 1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

3、血清（漿）樣品：直接檢測。

測定步驟

1. 分光光度計或酶標儀(yi) 預熱30min以上，調節波長至340nm，蒸餾水調零。

2. 樣本測定

（1）試劑二的配製：臨(lin) 用前取試劑二一瓶，加入9mL試劑一和1.06mL蒸餾水充分溶解，置於(yu) 37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）水浴5min；現配現用。

（2）試劑三的配製：臨(lin) 用前取試劑三一支，加入0.6mL蒸餾水充分溶解待用；現配現用。

（3）在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本、10μL試劑三和180μL試劑二，混勻，立即記錄340nm處20s時的吸光值A1和 2min20s後的吸光值A2，計算ΔA=A1-A2。

PK活性計算

a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1、血清（漿）中PK活力的計算:

單位的定義(yi) ：每毫升血清（漿）每分鍾消耗1 nmol的NADH定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

PK（nmol/min/mL）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷V樣÷T=1608×ΔA

2、組織、細菌或細胞中PK活力的計算:

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義(yi) ：每mg組織蛋白每分鍾消耗1 nmol的NADH定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

PK（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=1608×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義(yi) ：每g組織每分鍾消耗1 nmol的NADH定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

PK（nmol/min /g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W× V樣÷V樣總)÷T=1608×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位的定義(yi) ：每1萬(wan) 個(ge) 細菌或細胞每分鍾消耗1 nmol的NADH定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

PK（nmol/min /104 cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=3.216×ΔA

V反總：反應體(ti) 係總體(ti) 積，2×10-4 L；ε：NADH摩爾消光係數，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體(ti) 積，0.01 mL；V樣總：加入提取液體(ti) 積，1 mL；T：反應時間，2min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；500：細菌或細胞總數，500萬(wan) 。

b.用96孔板測定的計算公式如下

1、血清（漿）中PK活力的計算:

單位的定義(yi) ：每毫升血清（漿）每分鍾消耗1 nmol的NADH定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

PK（nmol/min /mL）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷V樣÷T=3216×ΔA

2、組織、細菌或細胞中PK活力的計算:

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義(yi) ：每mg組織蛋白每分鍾消耗1 nmol的NADH定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

PK（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=3216×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義(yi) ：每g組織每分鍾消耗1 nmol的NADH定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

PK（nmol/min /g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W× V樣÷V樣總)÷T=3216×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位的定義(yi) ：每1萬(wan) 個(ge) 細菌或細胞每分鍾消耗1 nmol的NADH定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

PK（nmol/min /104 cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=6.432×ΔA

V反總：反應體(ti) 係總體(ti) 積，2×10-4 L；ε：NADH摩爾消光係數，6.22×103 L / mol /cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體(ti) 積，0.01 mL；V樣總：加入提取液體(ti) 積，1 mL；T：反應時間，2min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；500：細菌或細胞總數，500萬(wan) 。

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