α酮戊二酸脫氫酶（αKGDH）測試盒

α酮戊二酸脫氫酶（αKGDH）測試盒

正式測定前務必取2-3個(ge) 預期差異較大的樣本做預測定

測定意義(yi)

α-KGDH（EC 1.2.4.2）廣泛存在於(yu) 動物、植物微生物和培養(yang) 細胞的線粒體(ti) 中，是三羧酸循環調控關(guan) 鍵酶之一，催化α-酮戊二酸氧化脫羧生成琥珀酰輔酶A。

測定原理

α-KGDH催化α-酮戊二酸、NAD+ 和輔酶A生成琥珀酰輔酶A、 二氧化碳和 NADH，NADH在340 nm有特征吸收峰，以NADH的生成速率表示α-KGDH活性。

需自備的儀(yi) 器和用品

紫外分光光度計/酶標儀(yi) 、水浴鍋、台式離心機、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配製

試劑一：100mL×1瓶，-20℃保存；

試劑二：20mL×1瓶，-20℃保存；

試劑三：1.5mL×1支，-20℃保存；

試劑四：液體(ti) 20mL×1瓶，4℃保存；

試劑五：粉劑×1瓶，-20℃保存；

試劑六：粉劑×1支，-20℃保存；

樣本的前處理：

組織、細菌或細胞中胞漿蛋白與(yu) 線粒體(ti) 蛋白的分離：

1. 稱取約0.1g組織或收集500萬(wan) 細胞，加入1mL試劑一和10uL 試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

2. 將勻漿600g，4℃離心5min。

3. 棄沉澱，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心10min。

4. 上清液即胞漿提取物，可用於(yu) 測定從(cong) 線粒體(ti) 泄漏的α-KGDH（此步可選做）。

5. 在步驟④的沉澱中加入200uL試劑二和2uL 試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W，超聲3秒，間隔10秒，重複30次），用於(yu) 線粒體(ti) α-KGDH活性測定。

測定步驟

1. 分光光度計或酶標儀(yi) 預熱30min以上，調節波長至340nm，蒸餾水調零。

2. 樣本測定

（1）在試劑五中加入18mL試劑四充分溶解，置於(yu) 37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）水浴10min；現配現用；

（2）在試劑六中加入1mL蒸餾水，充分溶解待用；用不完的試劑分裝後-20℃保存，禁止反複凍融；

（3）在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本、10μL試劑六和180μL試劑五，混勻，立即記錄340nm處20s時的吸光值A1和 2min20s後的吸光值A2，計算ΔA=A2-A1。

α-KGDH活性計算

（1） 按樣本蛋白濃度計算

單位的定義(yi) ：每mg組織蛋白每分鍾生成1 nmol的NADH定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

α-KGDH活性（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=1608×ΔA÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計算：

單位的定義(yi) ：每g組織每分鍾生成1 nmol的NADH定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

α-KGDH（nmol/min /g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T=325×ΔA÷W

（3） 按細菌或細胞密度計算：

單位的定義(yi) ：每1萬(wan) 個(ge) 細菌或細胞每分鍾生成1 nmol的NADH定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

α-KGDH活性（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=0.65×ΔA

V反總：反應體(ti) 係總體(ti) 積，2×10-4 L；ε：NADH摩爾消光係數，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體(ti) 積，0.01 mL；V樣總：加入提取液體(ti) 積，0.202 mL；T：反應時間，2min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；500：細菌或細胞總數，500萬(wan) 。

b.用96孔板測定的計算公式如下

（1） 按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義(yi) ：每mg組織蛋白每分鍾生成1 nmol的NADH定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活性單位。

α-KGDH活性（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=3216×ΔA÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計算：

單位的定義(yi) ：每g組織每分鍾生成1 nmol的NADH定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活性單位。

α-KGDH活性（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T=650×ΔA÷W

（3） 按細菌或細胞密度計算：

單位的定義(yi) ：每1萬(wan) 個(ge) 細菌或細胞每分鍾生成1 nmol的NADH定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活性單位。

α-KGDH活性（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=1.3×ΔA

V反總：反應體(ti) 係總體(ti) 積，2×10-4 L；ε：NADH摩爾消光係數，6.22×103 L / mol /cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體(ti) 積，0.01 mL；V樣總：加入提取液體(ti) 積，0.202 mL；T：反應時間，2min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；500：細菌或細胞總數，500萬(wan) 。

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