3-磷酸甘油醛脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenas

3-磷酸甘油醛脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)試劑盒

GAPDH催化3-磷酸甘油醛氧化生成1,3-二磷酸甘油酸，是糖酵解途徑的關(guan) 鍵酶，與(yu) 糖異生途徑、體(ti) 內(nei) 血糖濃度的維持和糖尿病的發生密切相關(guan) ，在機體(ti) 糖、脂、蛋白代謝紊亂(luan) 疾病中發揮重要作用。

測定原理

3-磷酸甘油酸激酶催化三磷酸甘油酸和ATP生成1,3二磷酸甘油酸。GAPDH逆向催化1,3二磷酸甘油酸和NADH生成3磷酸甘油醛、無機磷和NAD，340nm處測定NADH的減少量可反映GADPH活性的高低。

需自備的儀(yi) 器和用品

分光光度計/酶標儀(yi) 、恒溫水浴鍋、台式離心機、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配製

提取液一：液體(ti) 100mL×1瓶，4℃保存。

提取液二：液體(ti) 100mL×1瓶，4℃保存。

試劑一：粉劑×1瓶，-20℃保存；

試劑二：液體(ti) 20mL×1瓶，4℃保存；

試劑三：液體(ti) 14uL×1支，4℃保存；

組織樣本的前處理

①總GAPDH酶提取：建議稱取約0.1g樣本，加入1mL提取液一，冰浴勻漿後超聲破碎（冰浴，200W，破碎3s，間歇7s，總時間1min），然後4℃，8000g離心10min，取上清測定。

②胞漿和葉綠體(ti) GAPDH酶的分離：按照植物組織質量（g）：提取液體(ti) 積(mL)為(wei) 1：5～10的比例（建議稱取約0.1g樣本，加入1mL提取液一），冰浴勻漿後於(yu) 4℃，200g離心5min，棄沉澱，取上清在4℃，8000g離心10min，取上清用於(yu) 測定胞漿GAPDH酶活性，取沉澱加1mL提取液二，震蕩溶解後超聲破碎（冰浴，200W，破碎3s，間歇7s，總時間1min），然後4℃，8000g離心10min，取上清測定葉綠體(ti) 中GAPDH酶活性。

建議測定總GAPDH酶活性，按照步驟①提取粗酶液，若需要分別測定胞漿和葉綠體(ti) 中的GAPDH，則按照步驟②提取粗酶液。

細菌或培養(yang) 細胞的前處理

先收集細菌或細胞到離心管內(nei) ，離心後棄上清；按照細菌或細胞數量（104個(ge) ）：提取液一體(ti) 積（mL）為(wei) 500~1000：1的比例（建議500萬(wan) 細菌或細胞加入1mL提取液一），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重複30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

測定步驟

1. 分光光度計或酶標儀(yi) 預熱30min以上，調節波長至340nm，蒸餾水調零。

2. 樣本測定

（1）工作液的配製：將試劑二全部倒入試劑一瓶中，充分溶解，37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)預熱10分鍾；用不完的試劑分裝後-20℃保存，禁止反複凍融。

（2）在試劑三中加入500μL蒸餾水，充分混勻待用；用不完的試劑分裝後-20℃保存，禁止反複凍融。

（3）在微量石英比色皿或96孔板中加入5μL樣本、5μL試劑三和190μL工作液，混勻，加入最後一個(ge) 試劑的同時開始計時，記錄340nm處20s時的吸光值A1和 5min20s後的吸光值A2，計算ΔA=A1-A2。

GAPDH活性計算

a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下

（1）按樣本蛋白濃度計算

單位的定義(yi) ：每mg組織蛋白每分鍾消耗1 nmol的NADH定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

GAPDH（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=1286×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算

單位的定義(yi) ：每g組織每分鍾消耗1 nmol的NADH定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

GAPDH（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W ×V樣÷V樣總) ÷T=1286×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算

單位的定義(yi) ：每一萬(wan) 個(ge) 細菌或細胞每分鍾消耗1 nmol的NADH定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

GAPDH（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(500 ×V樣÷V樣總) ÷T=2.572×ΔA

V反總：反應體(ti) 係總體(ti) 積，2×10-4 L；ε：NADH摩爾消光係數，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體(ti) 積，0.005 mL；V樣總：加入提取液體(ti) 積，1 mL；T：反應時間，5 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；500：細菌或細胞總數，500萬(wan) 。

b.用96孔板測定的計算公式如下

（1）按樣本蛋白濃度計算

單位的定義(yi) ：每mg組織蛋白每分鍾消耗1 nmol的NADH定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

GAPDH（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=2572×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算

單位的定義(yi) ：每g組織每分鍾消耗1 nmol的NADH定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

GAPDH（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W ×V樣÷V樣總) ÷T=2572×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算

單位的定義(yi) ：每一萬(wan) 個(ge) 細菌或細胞每分鍾消耗1 nmol的NADH定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

GAPDH（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(500 ×V樣÷V樣總) ÷T=5.144×ΔA

V反總：反應體(ti) 係總體(ti) 積，2×10-4 L；ε：NADH摩爾消光係數，6.22×103 L / mol /cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體(ti) 積，0.005 mL；V樣總：加入提取液體(ti) 積，1 mL；T：反應時間，5 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；500：細菌或細胞總數，500萬(wan) 。

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• 中文名稱：甲泛葡胺

• 英文名稱：Metrizamide

分子式：C18H22I3N3O8

分子量：789.1

• CAS號：31112-62-6

  級別：Reagent Grade

• EINECS編號：250-475-5

• 儲(chu) 存條件：2～8℃

• 中文別名：甲泛葡胺、阿米派克、甲泛影酰胺、室椎影

• 英文別名：2-((3-(acetylamino)-5-(acetylmethylamino)-2,4,6-triiodobenzoyl)amino)-2-deox、2-(3-ace***ido-2,4,6-triiodo-5-(n-methylace***ido)benzamido)-2-deoxy-d-gluco

• 是否危險：否

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