LeapWal Cell Counting Kit-8 CCK-8，產(chan) 品編碼：P11110。

LeapWal Cell Counting Kit-8 CCK-8，描述：

它為(wei) 即用型試劑，使用方法十分便捷，可用於(yu) 大批量樣品的檢測。對細胞無明顯毒性，加入CCK-8溶液顯色後，可以在不同時間反複用酶標儀(yi) 讀板，使檢測時間更加靈活，便於(yu) 找到最佳測定時間，可應用於(yu) 細胞增殖和細胞生長抑製檢測、毒性測定、藥物篩選、腫瘤藥敏等試驗。

Cell Counting Kit-8，簡稱CCK-8或CCK8試劑盒，是一種基於(yu) WST-8（水溶性四唑鹽，化學名：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽）而廣泛應用於(yu) 細胞增殖和細胞毒性的快速、高靈敏度、無放射性的比色檢測試劑盒，是MTT、XTT、MTS等的優(you) 良替代方法。

WST-8是一種類似於(yu) MTT的化合物，在電子耦合試劑存在的情況下，可以被線粒體(ti) 內(nei) 的一些脫氫酶還原生成橙黃色的formazan (圖1) 。對於(yu) 相同起始量的細胞，細胞增殖越多越快，則顏色越深；細胞毒性越大，則顏色越淺。對於(yu) 同種細胞，顏色的深淺 (生成的formazan量) 與(yu) 細胞數目呈線性關(guan) 係 (圖3) 。

圖1. WST-8檢測原理圖（EC=electron coupling reagent，即電子耦合試劑）

WST-8是MTT的一種升級替代產(chan) 品，和MTT或其它MTT類似產(chan) 品如XTT、MTS等相比有以下明顯的優(you) 點：(1) MTT被線粒體(ti) 內(nei) 的一些脫氫酶還原生成的formazan不是水溶性的，需要有特定的溶液來溶解，而WST-8和XTT、MTS產(chan) 生的formazan都是水溶性的，可以省去後續的溶解步驟，WST-8產(chan) 生的formazan比XTT和MTS產(chan) 生的formazan更易溶解。(2) WST-8比XTT、MTS更加穩定，使實驗結果更加可靠。(3) WST-8和MTT、XTT等相比，線性範圍更寬，靈敏度更高。

Cell Counting Kit-8 CCK-8為(wei) 即用型試劑，使用方法十分便捷，無須再進行任何配製等操作，無須使用同位素，所有的檢測步驟僅(jin) 在同一塊96孔板內(nei) 即可完成。不必洗滌細胞，不必收集細胞，也不必采用額外的步驟溶解formazan，可以用於(yu) 大批量樣品的檢測。同時，WST-8對細胞無明顯毒性，加入CCK-8溶液顯色後，可以在不同時間反複用酶標儀(yi) 讀板，使檢測時間更加靈活，便於(yu) 找到最佳測定時間。Cell Counting Kit-8 CCK-8可以應用於(yu) 細胞增殖和細胞生長抑製檢測、毒性測定、藥物篩選、腫瘤藥敏等試驗。

02/產(chan) 品組分

03/保存條件

冰袋（wet ice）運輸。4℃避光保存，有效期12個(ge) 月。-20℃避光保存，有效期24個(ge) 月。

04/產(chan) 品特點

v 即用型試劑，無須再進行任何試劑的配製

v 對細胞無明顯毒性，檢測時間更加靈活，可在不同時間點反複/連續讀值

v 顯色穩定，使實驗結果更加可靠

v 線性範圍寬，靈敏度高

v 可用於(yu) 大批量樣品的檢測

05/實驗流程概要

06/實驗步驟

一. 製作標準曲線（使用此標準曲線的前提條件是試驗條件*一致）

1. 先用細胞計數板計數所製備的細胞懸液的細胞數量，然後接種細胞；

2.按比例依次用培養(yang) 基等比稀釋成一個(ge) 細胞濃度梯度，一般需要做5-7個(ge) 細胞濃度梯度，每組4-6 個(ge) 複孔；

3. 接種後培養(yang) 4-6小時使細胞貼壁（懸浮細胞可省略此步驟）；

4. 加入LeapWal Cell Counting Kit-8試劑（每100μL培養(yang) 基加10μL CCK-8）。培養(yang) 一定時間（0.5-4小時）後測定OD₄₅₀，製作出一條以細胞數量為(wei) 橫坐標，OD₄₅₀為(wei) 縱坐標的標準曲線，根據此標準曲線可以測定出未知樣品的細胞數量。

二. 細胞活性檢測

1. 在 96 孔板中接種細胞懸液（100μL/孔），將培養(yang) 板放在培養(yang) 箱中預培養(yang) 16-24小時；

2. 向每孔中加入10μL CCK-8溶液，切勿產(chan) 生氣泡，氣泡會(hui) 影響OD值的讀數；

3. 將培養(yang) 板置於(yu) 培養(yang) 箱內(nei) 孵育0.5-4小時；

4. 用酶標儀(yi) 測定450nm處的吸光度。

三. 細胞增殖-毒性檢測

1. 在96孔板中接種細胞懸液（100μL/孔），將培養(yang) 板放在培養(yang) 箱中預培養(yang) 16-24小時；

2. 向培養(yang) 板加入不同濃度的待測藥物（依據實驗者具體(ti) 方案而定）；

3. 將培養(yang) 板置於(yu) 培養(yang) 箱內(nei) 孵育一段時間（依據實驗者具體(ti) 方案而定）；

4. 向每孔加入10μL CCK-8溶液，切勿產(chan) 生氣泡，氣泡會(hui) 影響OD值的讀數；

5. 將培養(yang) 板置於(yu) 培養(yang) 箱內(nei) 孵育0.5-4小時；

6. 用酶標儀(yi) 測定450nm處的吸光度。

Ø 如果待測物質有氧化性或還原性，可在加入CCK-8之前，棄去舊培養(yang) 基，用培養(yang) 基洗滌細胞兩(liang) 次，然後加入新的培養(yang) 基，來去除藥物的影響。當藥物影響較小時，也可以不更換培養(yang) 基，直接扣除培養(yang) 基中加入藥物後的空白對照孔的吸光度值即可。

07/計算公式

細胞存活率=[(As-Ab) / (Ac-Ab)] × 100%

抑製率=[(Ac-As) / (Ac-Ab)] × 100%

As: 實驗孔吸光度（含細胞、培養(yang) 基、CCK-8溶液和藥物溶液）

Ac: 對照孔吸光度（含細胞、培養(yang) 基、CCK-8溶液，不含藥物）

Ab: 空白孔吸光度（含培養(yang) 基、CCK-8溶液，不含細胞、藥物）

08/適用範圍

1. 細胞增殖測定：CCK-8是水溶性的，在培養(yang) 基中穩定且無毒。

2. 細胞活性和細胞毒性分析：代謝活性以及染料的形成與(yu) 細胞的活性和損傷(shang) 成比例。

3. 細胞因子分析：測定細胞因子誘導的增殖，必要時，可在試驗結束時回收和擴增細胞。

09/注意事項

1. 使用96孔板進行檢測時，需考慮液體(ti) 蒸發問題。由於(yu) 96孔板周圍一圈最容易蒸發，建議棄用周圍一圈，改加等量的PBS、水或培養(yang) 液。

2. 細胞增殖實驗建議每孔加入100μL 2000個(ge) 細胞，細胞毒性實驗每孔加入100μL 5000個(ge) 細胞（具體(ti) 每孔所用的細胞數目，需根據細胞大小、細胞增殖速度等因素決(jue) 定）。按照實驗需要進行培養(yang) 並給予0-10μL 特定的藥物刺激。

3. 本試劑盒的檢測依賴於(yu) 脫氫酶催化的反應，還原劑（例如，抗氧化劑）會(hui) 幹擾檢測結果，如果待檢測體(ti) 係中存在較多的還原劑，需設法去除。

4. 測試藥物如含有金屬，對CCK-8顯色會(hui) 有影響。終濃度為(wei) 1mM的氯化亞(ya) 鉛、氯化鐵、硫酸銅會(hui) 抑製 5%，15%，90%的顯色反應，使靈敏度降低。如果終濃度是10mM，將會(hui) 100%抑製，需設法去除。

5. 培養(yang) 基中的酚紅不會(hui) 影響實驗結果，酚紅的吸光度可以在計算時通過扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不會(hui) 對檢測造成影響。

6. 檢測時，如果起始培養(yang) 體(ti) 積為(wei) 100μL，每孔加入10μL CCK-8溶液。如果起始培養(yang) 體(ti) 積為(wei) 200μL，則需加入20μL CCK-8溶液，其它情況以此類推。可以用加了相應量細胞培養(yang) 液和CCK-8溶液但沒有加入細胞的孔作為(wei) 空白對照。如果擔心所使用的藥物會(hui) 幹擾檢測，需設置加了相應量細胞培養(yang) 液、藥物和CCK-8溶液但沒有加入細胞的孔作為(wei) 空白對照。

7. CCK-8的培養(yang) 時間一般為(wei) 0.5-4小時，對於(yu) 大多數情況孵育1小時即可。孵育時間的長短需根據細胞類型和細胞密度等實驗情況而定，需要摸索條件，初次實驗時可以在0.5、1、2和4小時後分別用酶標儀(yi) 檢測，然後選取吸光度範圍比較適宜的時間點用於(yu) 後續實驗。

8. 在450nm測定吸光度。如無450nm濾光片，可以使用420-480nm的濾光片。可以使用大於(yu) 600nm的波長，例如650nm，作為(wei) 參考波長進行雙波長測定。

9. 酶標儀(yi) 檢測前需確保孔內(nei) 沒有氣泡，否則會(hui) 幹擾測定結果。

10. 需要測定細胞的具體(ti) 數量時，建議同時做標準曲線。

11. 若檢測樣本較多，建議采用多通道移液器，以減小工作量及平行孔間的差異。

12. 以下方法可以終止CCK-8反應(96孔板): (a)顯色反應後，將培養(yang) 板放置於(yu) 4℃冰箱內(nei) 。(b)每孔加入10μL 0.1M HCl溶液。(c)每孔加入10μL 1% (w/v) SDS (十二烷基硫酸鈉) 溶液。注意：反應停止後，應在24小時內(nei) 測定。

13. 為(wei) 了您的健康安全，請規範操作，穿戴實驗服與(yu) 手套開展實驗。

14. 本產(chan) 品僅(jin) 供科研使用，請勿用於(yu) 臨(lin) 床診斷及治療。

10/實驗案例分析

1. 將不同數量的HeLa細胞按照每孔100μL 培養(yang) 液接種於(yu) 96孔板中，培養(yang) 24小時後細胞充分貼壁，每孔加入10μL CCK-8溶液。

2. 孵育1小時後測定450nm的吸光度值，檢測結果如圖3所示。（檢測結果僅(jin) 供參考，實測數據會(hui) 因檢測儀(yi) 器等的不同而存在差異）

圖3: CCK-8 試劑盒檢測細胞活性

11/其他相關(guan) 產(chan) 品

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