Puromycin 嘌呤黴素，產(chan) 品編碼：PS610。

Puromycin 嘌呤黴素，

Puromycin (10 mg/mL)

01/產(chan) 品概述

Puromycin是來源於(yu) Streptomyces alboniger的一種氨基核苷類抗生素，中文名為(wei) 嘌呤黴素。嘌呤黴素是氨酰-tRNA分子3´末端的類似物，能夠與(yu) 核糖體(ti) 的A位點結合並摻入到延伸的肽鏈中。嘌呤黴素同A位點結合後，不會(hui) 參與(yu) 隨後的任何反應，從(cong) 而導致蛋白質合成的提前終止並釋放出C-末端含有嘌呤黴素的不成熟多肽，從(cong) 而殺死革蘭(lan) 氏陽性菌、各種動物和昆蟲細胞。

Puromycin常用於(yu) 篩選通過質粒轉染、病毒感染、轉化等方法能表達pac基因（puror）的真核或原核多克隆或單克隆細胞。pac基因編碼嘌呤黴素N-乙酰轉移酶 (PAC，Puromycin N-acetyl-tranferase)，賦予機體(ti) 對嘌呤黴素產(chan) 生抗性。這一特性目前普遍應用於(yu) 篩選表達pac基因的哺乳動物穩定細胞株。嘌呤黴素在細胞穩轉株篩選中的普遍應用與(yu) 慢病毒載體(ti) 的特性有關(guan) ，現在很多商業(ye) 化的慢病毒載體(ti) 都攜帶pac基因(一般在質粒圖譜上標記為(wei) puror)，從(cong) 而利用嘌呤黴素篩選特定基因的穩定表達細胞株。Puromycin的特點是快速作用於(yu) 細胞，一般2天內(nei) 可以殺死99% 的不表達pac基因的細胞。Puromycin不僅(jin) 用於(yu) 穩定細胞株的篩選，也用於(yu) 穩定細胞株的維持。在某些特定情況下，嘌呤黴素也可以用來篩選轉化攜帶pac基因質粒的大腸杆菌菌株、酵母菌株等。

本品是無菌的嘌呤黴素鹽酸鹽溶液（10 mg/mL），經過濾除菌，可以直接用於(yu) 細胞培養(yang) 。

02/產(chan) 品組分

03/保存條件

冰袋（wet ice）運輸。-20℃ 保存，有效期12個(ge) 月。建議分裝保存，避免反複凍融。

04/產(chan) 品特點

v 即用型試劑，無需進行試劑配置，簡單方便。

v 無菌製劑，可直接加入細胞使用。

05/實驗步驟

一、Dose-response curve or kill curve嘌呤黴素劑量反應曲線的確定(以shRNA轉染或者慢病毒感染為(wei) 例）

嘌呤黴素的有效篩選濃度跟細胞類型、生長狀態、細胞密度、細胞代謝及細胞所處細胞周期等因素相關(guan) 。為(wei) 了篩選到穩定表達的shRNA或感染病毒的細胞株，確定殺死未轉染/感染細胞的最小濃度嘌呤黴素非常重要。 對於(yu) 初次使用的細胞，一般需要通過實驗來確定適合自身實驗體(ti) 係的劑量反應曲線(dose-response curve or kill curve)。

1. 提前一天在24孔板中以5~8×104cells/孔的密度接種細胞，設置劑量梯度及複孔，37℃ 5% CO2細胞培養(yang) 箱內(nei) 培養(yang) 過夜。

2. 次日，將培養(yang) 過夜後的細胞更換含不同濃度嘌呤黴素的篩選培養(yang) 基（新鮮配置），

如0、1、2.5、5、7.5、10、15、20 μg/mL等濃度梯度，設置至少5個(ge) 濃度梯度，37℃ 5% CO2細胞培養(yang) 箱中繼續培養(yang) 。

3. 由於(yu) 嘌呤黴素可以快速作用於(yu) 細胞，一般2天內(nei) 可以殺死99% 的未表達pac基因的細胞，所以在添加嘌呤黴素後的1-2天就可以觀察細胞存活率，從(cong) 而確定有效殺死正常細胞的藥物最小濃度。如果細胞耐藥性比較強，需要每日監測細胞，觀察存活細胞率，約 2-3 天更換新鮮的篩選培養(yang) 基，一般4-10天內(nei) 即可確定嘌呤黴素的最小濃度。

二、建議使用濃度

哺乳動物細胞：1-10 μg/mL，最佳濃度需根據嘌呤黴素劑量反應曲線來確定。

大腸杆菌：LB瓊脂培養(yang) 基篩選穩定轉化pac基因的大腸杆菌，使用濃度為(wei) 125 μg/mL。

Ø 使用嘌呤黴素篩選大腸杆菌穩轉株需要精確的pH值調節，並受宿主細胞本身的影響。

三、哺乳動物穩定表達細胞株的篩選

轉染含有pac基因的質粒或者感染含有該基因的病毒後，即可使用嘌呤黴素篩選穩定表達株。

1. 細胞轉染或感染48小時後，將細胞置於(yu) 含有適當濃度嘌呤黴素的新鮮培養(yang) 基中培養(yang) ，此為(wei) 處理組。

Ø 當細胞處於(yu) 分裂活躍期時，抗生素作用明顯。細胞過於(yu) 密集，抗生素產(chan) 生的效力會(hui) 明顯下降，所以細胞的密度最好不超過35%。轉染或感染48小時後，如果細胞過密也可以消化後重新接種細胞，培養(yang) 過夜後即可進行嘌呤黴素篩選。

Ø 建議同時做一個(ge) 空白正常細胞的對照組。

2. 每隔2-3天，更換含有嘌呤黴素的培養(yang) 基。

3. 篩選2-10天後，對照組正常細胞應該100% 死亡，處理組中存活的細胞為(wei) 表達pac基因的細胞。然後根據實驗目的進行多克隆或單克隆細胞的篩選。

Ø 應每日進行細胞生長狀態的觀察。嘌呤黴素的篩選至少需要24小時，有效濃度嘌呤黴素的篩選周期一般在2-10天。

4. 待細胞可以穩定生長後，嘌呤黴素的濃度可以減半用於(yu) 後續的培養(yang) 。在得到穩定表達細胞株後，一般建議嘌呤黴素也須持續加入，並2-3天更換含有嘌呤黴素的新鮮培養(yang) 液。

06/適用範圍

Puromycin普遍應用於(yu) 穩定細胞株的篩選和維持，也可以用來篩選轉化攜帶pac基因質粒的大腸杆菌菌株、酵母菌株等。

07/注意事項

1. 為(wei) 了您的健康安全，請規範操作，穿戴實驗服與(yu) 手套開展實驗。

2. 本產(chan) 品對人體(ti) 有害，操作時請小心，並注意有效防護以避免直接接觸人體(ti) 或吸入體(ti) 內(nei) 。

3. 本產(chan) 品僅(jin) 供科研使用，請勿用於(yu) 臨(lin) 床診斷及治療。

08/實驗案例分析

1. 提前一天使用10 cm細胞培養(yang) 皿培養(yang) ViralStars Lentivirus Packaging Cell Line（CL110001），待細胞密度為(wei) 75% 左右開始包裝慢病毒。

2. 使用ViralStars LP Lentivirus Packaging Kit（LP110-10）進行慢病毒包裝，具體(ti) 步驟參考LP110-10產(chan) 品說明書(shu) 。

3. 收集慢病毒上清液，300xg離心10分鍾以除去細胞碎片，0.22 μm濾器過濾，使用ViralStars LC Lentivirus Concentration Solution慢病毒濃縮試劑盒（LC110R）進行20倍濃縮，使用1 mL ViralStars LS Lentivirus Storage Solution（LS110R）重懸慢病毒顆粒。

4. 提前一天在24孔板中鋪Hela細胞，使用上述製備的慢病毒感染目的細胞HeLa。在EP管中做病毒10倍梯度稀釋，連續6個(ge) 稀釋梯度。稀釋方法如下：準備6個(ge) ⽆菌EP管，每個(ge) EP管中加⼊450μL 新鮮的*培養(yang) 基（含10 μg/mL polybrene），取待測定病毒液50 μL加⼊到第⼀個(ge) EP管中（標記50 μL），混勻後取50 μL病毒稀釋液加⼊到第⼆個(ge) EP管中（標記5 μL），以此類推，直到稀釋到最後⼀管。棄去24孔板中原有的培養(yang) 基，將稀釋好的病毒依次加入孔中，並做好標記，⼩⼼操作，不要吹起細胞，置於(yu) 培養(yang) 箱中培養(yang) 16 h。

5. 慢病毒感染16 h後，吸去帶病毒的培養(yang) 基，在每個(ge) 孔中再加入
500 μL
預熱的新鮮*培養(yang) 基。

6. 使用含puromycin（5 μg/mL）的篩選培養(yang) 基進行篩選，對篩選7天後的細胞進行結晶紫染色，並拍照記錄，實驗結果如圖2所示。

09/其他相關(guan) 產(chan) 品

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