如何選擇合適的二抗？

二抗用於(yu) 多種免疫測定中，以檢測一抗的存在。這些抗體(ti) 與(yu) 酶、生物分子或熒光染料偶聯，以便檢測一抗。與(yu) 一抗不同，二抗針對一抗的物種和同種型產(chan) 生，並通過在多個(ge) 位點與(yu) 一抗結合來檢測一抗。

要成功選擇二抗，應考慮以下因素：

確保良好匹配 – 宿主物種是產(chan) 生二抗的動物，應始終與(yu) 一抗的宿主不同。例如，如果您使用在兔子中產(chan) 生的一抗，您將需要在兔子以外的其他物種（如山羊、驢或小鼠）中產(chan) 生的抗兔二抗（圖 1）。

圖 1：二抗機製。

完整的抗體(ti) 還是片段？ – 實際上，真正的問題是“您的一抗是單克隆還是多克隆？這兩(liang) 個(ge) 問題的答案通常取決(jue) 於(yu) 應用程序。單克隆一抗包含免疫球蛋白的單一同種型。因此，使用特異性識別該同種型的二抗至關(guan) 重要。此外，單克隆抗體(ti) 通常在小鼠、兔子和大鼠中產(chan) 生。因此，如果一抗是小鼠 IgG1，您將需要抗小鼠 IgG 或特異性較低的 F（ab） 片段抗小鼠 IgG。抗體(ti) 片段適合免疫組化和免疫熒光，因為(wei) 它們(men) 體(ti) 積較小且能夠穿透組織。然而，較小的尺寸可能會(hui) 限製與(yu) 片段偶聯的染料或酶的選擇，從(cong) 而導致二抗的靈敏度可能不如全抗體(ti) 選擇。

多克隆一抗包含免疫球蛋白 G 的幾種同種型的混合物。因此，為(wei) 了最大限度地檢測靶標，最好使用可識別所有同種型的二抗。多克隆抗體(ti) 通常在兔、山羊、綿羊和驢中以全抗體(ti) 形式（重鏈 + 輕鏈）飼養(yang) ，因此必須用來自不同物種的 IgG 庫對二級宿主物種進行免疫，從(cong) 而使純化的二抗能夠識別所有形式。例如，如果一抗多克隆抗體(ti) 是山羊 IgG，則需要抗山羊 IgG （H+L）。然而，全抗體(ti) 會(hui) 導致高背景和低特異性，因為(wei) 輕鏈由所有免疫球蛋白共享，這會(hui) 增加交叉反應性（圖 2）。

圖 2：免疫測定中全 IgG 二抗與(yu) 片段化二抗的結合機製。

根據您的應用選擇偶聯物 - 這取決(jue) 於(yu) 二抗如何檢測信號。例如，免疫組織化學、ELISA 和蛋白質印跡應用使用基於(yu) 生物素標記的比色和化學發光檢測來放大信號並提高靈敏度，以及與(yu) 辣根過氧化物酶 （HRP） 或堿性磷酸酶 （AP） 起作用的酶促反應。然而，對於(yu) 免疫標記、熒光顯微鏡和流式細胞術實驗，使用熒光染料（如 Alexa Fluor）檢測信號，這些染料直接與(yu) 抗體(ti) 偶聯以放大信號和靈敏度。

親(qin) 和純化抗體(ti) 與(yu) 交叉吸附抗體(ti)  – 此步驟用於(yu) 提高抗體(ti) 的特異性，並且可以在親(qin) 和純化和交叉吸附方麵進行區分。大多數二抗通過親(qin) 和層析進行純化，從(cong) 而產(chan) 生高親(qin) 和力抗體(ti) 。這種抗體(ti) 通常用於(yu) IHC，因為(wei) 它們(men) 提供最小的非特異性結合，也可用於(yu) western blot 以檢測低豐(feng) 度蛋白質。交叉吸附的二抗通常會(hui) 經過額外的純化步驟，以過濾掉與(yu) 脫靶免疫球蛋白種類結合的成員。此步驟增加了它們(men) 的特異性並降低了非特異性背景。這些抗體(ti) 專(zhuan) 為(wei) 免疫組織化學等特定應用而設計。