肽是怎麽合成的？

內(nei) 容

1.化學
2.液相合成
3.固相合成
3.1.中國銀行SPPS
3.2.Fmoc SPPS
4.固體(ti) 支持物
4.1.聚苯乙烯樹脂
4.2.聚酰胺樹脂
5.保護團體(ti)
5.1.Fmoc保護基團
5.2.Boc保護基團
5.3.苄氧羰基(Z)基團
5.4.Alloc保護基團
5.5.平版保護基團
6.激活組
6.1.碳化二亞(ya) 胺
6.2.芳香肟
7.合成長肽
8.固相肽合成的一個(ge) 例子
9.參考

1.化學

肽是通過將一個(ge) 氨基酸的羧基或C端偶聯到另一個(ge) 氨基酸的氨基或N端而合成的。

2.液相合成

液相肽合成是肽合成的經典方法。在大多數實驗室中，它已被固相合成所取代(見下文)。然而，它在用於(yu) 工業(ye) 目的的肽的大規模生產(chan) 中仍然有用。

3.固相合成

Merrifield固相肽合成(SPPS)導致了肽合成領域的範式轉變。這是目前實驗室以合成方式製造肽和蛋白質的方法。SPPS允許合成難以在細菌中表達的天然肽、摻入非天然氨基酸、肽/蛋白質骨架修飾以及合成由D-氨基酸組成的D-蛋白質。

小珠子用接頭處理，在接頭上可以構建肽鏈。合成珠將保持與(yu) 肽的強結合，直到被試劑裂解。珠子創造了一種合成環境，在這種環境中，產(chan) 生的肽鏈不會(hui) 通過過濾材料，而用於(yu) 產(chan) 生肽鏈的試劑會(hui) 通過。

重點考慮在每一步中產(chan) 生高的產(chan) 量。例如，如果每個(ge) 步驟具有99%的產(chan) 率，26個(ge) 氨基酸的肽將以77%的最終產(chan) 率合成，如果每個(ge) 步驟是95%，它將以25%的產(chan) 率合成。因此，每一種氨基酸都是以大大過量(2 ~ 10倍)添加的，並且通過一係列充分表征的試劑將氨基酸偶聯在一起是高度優(you) 化的

有兩(liang) 種主要的SPPS形式——Fmoc和Boc。與(yu) 核糖體(ti) 蛋白質合成不同，固相肽合成以C-末端到N-末端的方式進行。氨基酸單體(ti) 的N-末端被這兩(liang) 個(ge) 基團保護，並被加到去保護的氨基酸鏈上。

自動合成器可用於(yu) 這兩(liang) 種技術，盡管許多研究小組繼續手動執行spp。

SPPS受到產(chan) 量的限製，通常70~100個(ge) 氨基酸範圍內(nei) 的肽和蛋白質正在推動合成可及性的極限。合成難度也依賴於(yu) 序列；典型的澱粉樣肽和蛋白質很難製造。通過使用天然化學連接將兩(liang) 個(ge) 肽偶聯在一起，可以獲得更長的長度，並具有定量的產(chan) 量。

3.1.中國銀行SPPS

當R. B. Merrifield在1963年發明SPPS時，它是根據tBoc方法。t-Boc(或Boc)代表叔丁氧羰基。為(wei) 了從(cong) 生長的肽鏈上去除Boc，使用酸性條件(通常是純TFA)。在合成結束時，通過在氫氟酸中孵育(這可能是危險的)，從(cong) 樹脂中除去側(ce) 鏈保護基團和肽；由於(yu) 這個(ge) 原因，Boc化學通常不受歡迎。然而，對於(yu) 複雜的合成，Boc是有利的。當合成對堿基敏感的非天然肽類似物(如depsi肽)時，Boc是必需的。

4.固體(ti) 支持物                        

固相支持物的物理性質及其可用於(yu) 的應用，隨著構建支持物的材料、交聯的量以及所用的接頭和手柄而變化。

4.1.聚苯乙烯樹脂

這是一種多功能樹脂，由於(yu) 其在DCM中的溶脹最小，因此在多孔自動化肽合成中非常有用。

4.2.聚酰胺樹脂

這也是一種有用和多用途的樹脂。它似乎比聚苯乙烯膨脹得多，在這種情況下，如果孔太小，它可能不適合一些自動合成器。

5.保護團體(ti)

由於(yu) 在每個(ge) 合成步驟中使用過量的氨基酸來確保偶聯，在每個(ge) 氨基酸未被保護的反應中，氨基酸的聚合是常見的。為(wei) 了防止這種聚合，使用了保護基團。這給合成反應增加了額外的去保護階段，產(chan) 生了如下的重複設計流程:

• 在去保護反應中，保護基團從(cong) 尾部氨基酸中被除去

• 洗去脫保護試劑以提供清潔的偶聯環境

• 溶解在溶劑如二甲基甲酰胺(DMF)中的受保護的氨基酸與(yu) 偶聯劑混合，泵送通過合成柱

• 洗去偶聯試劑以提供幹淨的去保護環境

目前，固相肽合成中通常使用兩(liang) 種保護基團(Fmoc，Boc)。它們(men) 的不穩定性是由氨基甲酸酯基團引起的，氨基甲酸酯基團容易釋放CO2用於(yu) 不可逆的解偶聯步驟。

5.1.Fmoc保護基團

Fmoc(9-芴基甲基氨基甲酸酯)是目前廣泛使用的保護基團，其通常在從(cong) 氨基酸單元重複合成肽的過程中從(cong) 肽的N末端除去。Fmoc的優(you) 點是它在非常溫和的堿性條件下(例如呱啶)被裂解，但在酸性條件下穩定。這使得在堿性條件下穩定的溫和的酸不穩定保護基團，例如Boc和苄基，被用於(yu) 目標肽的氨基酸殘基的側(ce) 鏈上。這種正交保護基策略在有機合成領域很常見。

5.3.苄氧羰基(Z)基團

另一種基於(yu) 氨基甲酸酯的基團是苄氧羰基(Z)基團。它在更苛刻的條件下被去除:溴化氫/乙酸或催化氫化。今天，它幾乎用於(yu) 側(ce) 鏈保護。

5.4.Alloc保護基團

當需要鄰位去保護方案時，烯丙氧基羰基(alloc)保護基團通常用於(yu) 保護羧酸、羥基或氨基。有時在進行樹脂上環肽形成時使用，其中肽通過側(ce) 鏈官能團與(yu) 樹脂連接。可以使用四(三苯基膦)鈀(0)以及氯仿、乙酸和N-甲基嗎啉(NMM)的37∶2∶1混合物2小時來除去alloc基團。然後，必須用0.5 % DIPEA的DMF溶液、3×10ml 0.5%二乙基硫代氨基甲酸鈉的DMF溶液以及5×10ml 1:1 DCM:DMF溶液仔細清洗樹脂。

5.5.平版保護基團

對於(yu) 特殊應用，如蛋白質微陣列，使用平版印刷保護基團。這些基團可以通過曝光去除。

6.激活組

為(wei) 了偶聯肽，羧基通常被活化。這對加速反應很重要。有兩(liang) 種主要類型的活化基團:碳二亞(ya) 胺和芳香肟。

6.1.碳化二亞(ya) 胺

這些活化劑最初是被開發出來的。最常見的是二環己基碳二亞(ya) 胺(DCC)和二異丙基碳二亞(ya) 胺(DIC)。與(yu) 羧酸反應生成高活性的O-酰基脲。在人工蛋白質合成過程中(如Fmoc固態合成儀(yi) )，C末端通常用作氨基酸單體(ti) 添加的附著位點。為(wei) 了增強羧酸基團的親(qin) 電性，帶負電荷的氧必須首先被“活化"成更好的離去基團。DCC用於(yu) 此目的。帶負電荷的氧將充當親(qin) 核試劑，攻擊DCC中的中心碳。DCC暫時連接到以前的羧酸酯基團(現在是酯基團)，使得氨基(在連接的氨基酸上)對以前的C-末端(碳酰基)的親(qin) 核攻擊更有效。碳二亞(ya) 胺的問題是它們(men) 反應性太強，因此會(hui) 導致氨基酸的外消旋化。

最新的發展省略了碳二亞(ya) 胺。活性酯作為(wei) 非親(qin) 核陰離子(四氟硼酸鹽或六氟磷酸鹽)的脲鹽或鏻鹽引入:HBTU、HATU、PyBOP。

7.合成長肽

逐步延伸，其中氨基酸逐步依次連接，對於(yu) 含有2至100個(ge) 氨基酸殘基的小肽是理想的。另一種方法是片段縮合，其中肽片段被偶聯。雖然前者可以延長肽鏈而不發生外消旋化，但如果僅(jin) 用於(yu) 產(chan) 生長肽或高極性肽，產(chan) 量會(hui) 下降。對於(yu) 合成複雜的長肽來說，片段縮合比逐步延伸更好，但是為(wei) 了防止外消旋化，必須限製它的使用。片段縮合也是不希望的，因為(wei) 偶聯的片段必須大大過量，這可能是一個(ge) 取決(jue) 於(yu) 片段長度的限製。

產(chan) 生更長肽鏈的一個(ge) 新進展是化學連接:未保護的肽鏈在水溶液中發生化學選擇性反應。第一個(ge) 動力學控製的產(chan) 物重排形成酰胺鍵。最常見的天然化學連接形式使用與(yu) 末端半胱氨酸殘基反應的肽硫酯。

8.固相肽合成的一個(ge) 例子

以下是使用堿不穩定的9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)保護基團在聚酰胺或聚苯乙烯樹脂上合成肽的合成步驟的概述。使用下麵概述的技術，將獲得在N-末端用乙酰基封端，在C-末端用伯酰胺(CONH2)封端的肽。

為(wei) 手動肽合成設置玻璃器皿

手動肽合成可以在具有三通閥的燒結過濾器反應容器中完成，該三通閥通過1孔塞子安裝在1 L側(ce) 臂真空燒瓶上。一個(ge) 閥門用於(yu) 充入氮氣，氮氣首先通過一個(ge) 小的Drierite柱，然後進入反應混合物以攪拌溶液和混合試劑。另一個(ge) 閥門用於(yu) 排空過量的反應溶液，並使用真空瓶洗滌溶劑。用於(yu) 固相合成的所有玻璃片應在使用前用矽烷化試劑(如DCM中的1-5%二甲基二氯矽烷)處理，以避免靜電荷的積累，靜電荷的積累會(hui) 使樹脂很難處理。

聚酰胺樹脂的製備

聚酰胺(PL-DMA)樹脂(1g)用乙二胺(40 ml)在50 ml Falcon管中在搖床上處理過夜，然後過濾，用5×10ml 1:1二甲基甲酰胺(DMF):二氯甲烷(DCM)溶液、5×10ml 1:1 DCM洗滌，並使用苯並三唑-1-基-氧基三吡咯烷六氟磷酸鹽(PyBOP) (3 eq)、1-羥基苯並三唑水合物(HOBt) (3 eq)和二異丙基乙胺(DIPEA)裝載Fmoc-Rink然後可以在真空下幹燥，並儲(chu) 存在-15攝氏度，直到需要。

在合成前和合成過程中處理樹脂

樹脂首先在10毫升1∶1 DCM∶DMF中溶脹15分鍾，然後瀝幹。每次完成氨基酸偶聯後，還用5×10ml 1:1 DCM和DMF洗滌樹脂。

Fmoc-去保護

每次氨基酸偶聯後，用2×10ml 20%呱啶的DMF溶液進行Fmoc去保護，每次處理用N2攪拌10分鍾。然後用5×10毫升DMF洗滌樹脂，接著用5×10毫升1:1 DCM:DMF洗滌。

添加氨基酸

為(wei) 了在Fmoc-聚酰胺-Rink樹脂上開始肽合成，通過用呱啶處理樹脂來除去Fmoc基團。然後使用在1∶1 DCM∶DMF中的PyBOP (3 eq)、HOBt (3 eq)和DIPEA (6 eq)將第一個(ge) 氨基酸偶聯至樹脂的Fmoc-去保護的N-末端胺，或之前偶聯的氨基酸，直到樹脂對茚三酮呈陰性。

監測氨基酸偶聯的進展

氨基酸偶聯的過程可以用茚三酮或對氯醌來跟蹤。茚三酮溶液在遊離伯胺的存在下變成深藍色(陽性結果)，但在其他情況下是無色的(陰性結果)。如果使用乙醛作為(wei) 溶劑，在伯胺的存在下，或者如果使用丙酮，在仲胺的存在下，對-氯醌溶液將使樹脂珠變成深黑色或藍色；否則珠子保持無色或淡黃色。(測試概述如下)

茚三酮測試(1)

向微量離心管中加入2滴40%苯酚的乙醇溶液、2滴0.014 M KCN的吡啶溶液和4滴5%茚三酮的乙醇溶液，以及抹刀一端大小的樹脂樣品，然後渦旋混合物，並在100°c下加熱5分鍾

用氯醌測試(2)

向微量離心管中加入5滴丙酮或乙醛、5滴對氯醌的甲苯飽和溶液，以及小刮刀一端大小的樹脂樣品，然後渦旋混合物，並在室溫下靜置5分鍾。丙酮用於(yu) 檢測仲胺，乙醛用於(yu) 檢測伯胺。

持續肽延伸

一旦氨基酸的偶聯完成，就洗滌樹脂，用呱啶去保護Fmoc基團，並再次洗滌樹脂，為(wei) 下一次偶聯做準備。重複這一過程，直到添加完所有必需的氨基酸。

乙酰化N-末端

肽序列完成後，可以用2ml 1:1乙酸酐和三乙胺在10ml 1:1 DCM:DMF中乙酰化N-末端胺1小時或直到茚三酮陰性，然後用5×10ml 1:1 DCM:DMF洗滌樹脂，然後將肽從(cong) 樹脂上切下。如果需要，N-末端也可以作為(wei) 遊離胺留下。

從(cong) 樹脂上切割肽

用3×10ml 96∶2∶2的TFA、三異丙基矽烷(TIPS)和水(H2O)處理樹脂，每次處理10分鍾，然後過濾掉樹脂，將合並的濾液靜置1小時，以確保除去酸不穩定的保護基團。

從(cong) 樹脂上切割後肽的處理

將TFA在旋轉蒸發器上蒸發至幹(或重油或玻璃，如果它不凝固的話)，隨後向燒瓶中加入5 ml*醚以沉澱肽，並除去大部分副產(chan) 物。將肽和乙*的懸浮混合物加入到50 ml Falcon管中，並以3000 rpm的速度旋轉10-20分鍾(IEC離心機),直到可以倒出乙*而不損失任何肽。加入更多的後，通過渦旋使肽重新懸浮。再次離心混合物，倒出，洗滌過程重複兩(liang) 次以上。最後，產(chan) 品可以在脫粘器中的Falcon管中風幹過夜。

通常使用製備型HPLC來純化最終產(chan) 物。獲得質譜數據以確保獲得目標肽。