使用點擊化學測定細胞增殖和 DNA 複製

細胞增殖測定廣泛應用於(yu) 細胞毒性研究、癌症研究和細胞生物學的許多其他領域。其中許多可以通過熒光標記對增殖細胞進行可視化，並且適合高通量篩選。

檢測複製的 DNA 可以說是檢測增殖的最直接方法。這是通過使用溴脫氧尿苷 (BrdU)核苷實現的，該核苷在複製過程中融入 DNA。然後，細胞 DNA 中的這些核苷修飾可以通過抗 BrdU 抗體(ti) 檢測到。盡管具有特異性，但這種測定方法繁瑣且難以重現，因為(wei) 需要用刺激性試劑處理細胞，以使 DNA 暴露於(yu) 抗體(ti) ，否則這些抗體(ti) 不會(hui) 穿透細胞結構。

一種更溫和的替代方案是乙炔基脫氧尿苷 (EdU)，可以通過將其添加到培養(yang) 基中或注射到動物體(ti) 內(nei) 來將其遞送至細胞。摻入 DNA 後，該核苷可在銅 (I) 催化下與(yu) 各種熒光染料疊氮化物結合，從(cong) 而對複製的 DNA 進行熒光染色。該測定易於(yu) 執行、快速且可重複。它不需要對細胞進行嚴(yan) 酷的處理（隻需要用 Triton 進行透化），因此可以更好地保存細胞結構。在用疊氮化染料處理和最後的洗滌步驟（步驟 8）後，可以使用具有各種發射波長的熒光團（例如 Hoechst、DAPI或熒光標記抗體(ti) ）來標記細胞。

所需試劑

• 5-乙炔基-2'-脫氧尿苷 (EdU)

• 銅 (II)-BTTAA 絡合物— сlick сhemistry 催化劑

• 抗壞血酸— 銅的還原劑

• 疊氮化物熒光染料

• DMSO，標簽級— 疊氮化物溶劑

• Triton X-100（或 Tween-20）

• PBS，pH 7.4

• 100 mM Tris 緩衝(chong) 液，pH 7.4

協議

確切的方案取決(jue) 於(yu) 特定的細胞或組織類型，但一般工作流程如下所述：

1. 將細胞/組織與(yu) 10–20 μM EdU 孵育所需的時間。

2. 用含 3.7% 甲醛的 PBS 固定細胞 15 分鍾。

3. 用 PBS 清洗細胞。

4. 用含有 0.2% Triton X-100（或 0.5% Tween-20）的 PBS 透化細胞 30 分鍾。

5. 再次用 PBS 清洗細胞。

6. 在 100 mM Tris 緩衝(chong) 液，pH 7.4（對於(yu) 磺化疊氮化物）或 100 mM Tris 緩衝(chong) 液，pH 7.4（含 50% DMSO）中製備含有 2 mM 銅 (II)-BTTAA 複合物、10 mM 抗壞血酸和 5 μM 疊氮化染料的混合物（對於(yu) 非磺化疊氮化物）。該混合物應新鮮製備，因為(wei) 銅 (I) 在水溶液中不穩定。

7. 將細胞與(yu) 點擊反應混合物一起孵育 30 分鍾。

8. 用 PBS 清洗細胞。

9. （可選）如果細胞必須用不同的熒光團標記，請使用標準方案繼續染色。

磺化（水溶性）疊氮化物，例如磺基氰疊氮化物和 AF 疊氮化物，可產(chan) 生最佳效果。當使用非磺化疊氮化物（例如氰疊氮化物或 BDP 疊氮化物）時，確保反應混合物中 DMSO 濃度為(wei) 50%。