細菌保存指南：冷藏、冷凍和冷凍幹燥

在原種培養(yang) 物、突變菌株和基因工程變體(ti) 之間，任何一個(ge) 實驗室可以積累的單個(ge) 細菌培養(yang) 物的數量可能很多。事實上，在設計一個(ge) 質粒的過程中產(chan) 生的變異數量可能是驚人的。大多數實驗室都會(hui) 保留所有這些和其他變化，因為(wei) 你永遠不知道明天可能需要什麽(me) 。因此，保存所有這些細菌培養(yang) 物和遺傳(chuan) 變異是需要深思熟慮的事情。 

加蓋試管中的細菌培養(yang) 物處於(yu) 封閉環境中。盡管培養(yang) 物開始時可能是健康的，但隨著時間的推移，活細胞的數量將減少到零。保存培養(yang) 物的目的是降低死亡率，以便在重新進行培養(yang) 物時，一些細胞仍然存活並可用於(yu) 培養(yang) 。細胞死亡的原因可能有很多，但在每種情況下都是基於(yu) 細胞及其環境的固有化學性質。如果有害的化學反應可以減慢或停止，那麽(me) 整個(ge) 培養(yang) 物將在更長的時間內(nei) 保持活力。   

有兩(liang) 種基本方法可以減緩細菌培養(yang) 物中有害反應的速度。第一個(ge) 是降低溫度，從(cong) 而降低所有化學反應的速率。這可以使用冰箱、機械冷凍機和液氮冷凍機來完成。第二種選擇是從(cong) 培養(yang) 物中去除水，這個(ge) 過程可能很棘手，並且涉及使用凍幹機升華水。   

以下是保存細菌的主要選擇的簡要討論。報告了每個(ge) 選項的優(you) 點和缺點。 

冷藏

細菌在 4°C 下可以短暫存活。對於(yu) 每天或每周使用的菌株，在瓊脂斜麵或平板上生長的培養(yang) 物可以儲(chu) 存在冰箱中，前提是已采取預防措施以避免汙染。應使用標準技術製備培養(yang) 物，然後在儲(chu) 存前密封。對於(yu) 傾(qing) 斜，我們(men) 建議使用螺旋蓋管。對於(yu) 培養(yang) 皿上的培養(yang) 物，需要用封口膜密封培養(yang) 皿。密封板不僅(jin) 有助於(yu) 防止黴菌潛入板中，而且還能減緩瓊脂的幹燥速度。對於(yu) 超過一周或兩(liang) 周的情況，培養(yang) 物可以以刺的形式儲(chu) 存在小平底螺旋蓋小瓶中。在該技術中，小瓶中充滿少量瓊脂培養(yang) 基（例如1ml）並滅菌。然後用無菌針將細菌引入固化的瓊脂中。將培養(yang) 物用鬆蓋孵育過夜，然後用緊蓋保存在 4°C 下。儲(chu) 存在刺棒中的培養(yang) 物更能抵抗幹燥和汙染，但它們(men) 會(hui) 比冷凍儲(chu) 存更快地失去活力。刺傷(shang) 可以保持活力的時間長度取決(jue) 於(yu) 應變。一些手冊(ce) 聲稱刺針可以使用一年，但除非經過測試，否則做出這種假設是不明智的。刺傷(shang) 可以保持活力的時間長度取決(jue) 於(yu) 應變。一些手冊(ce) 聲稱刺針可以使用一年，但除非經過測試，否則做出這種假設是不明智的。刺傷(shang) 可以保持活力的時間長度取決(jue) 於(yu) 應變。一些手冊(ce) 聲稱刺針可以使用一年，但除非經過測試，否則做出這種假設是不明智的。 

冷凍

冷凍是儲(chu) 存細菌的好方法。一般來說，儲(chu) 存溫度越低，培養(yang) 物保留活細胞的時間越長。冷凍櫃可分為(wei) 三類：實驗室冷凍櫃、超低溫冷凍櫃和低溫冷凍櫃。儲(chu) 存在冰箱中的細菌（和其他細胞）麵臨(lin) 的問題是冰晶。冰會(hui) 因局部鹽濃度增加導致脫水而損害細胞。當水轉化為(wei) 冰時，溶質積聚在殘留的遊離水中，這種高濃度的溶質會(hui) 使生物分子變性。冰也會(hui) 使細胞膜破裂，盡管這個(ge) 問題通常與(yu) 缺乏細胞壁的細胞有關(guan) ，例如培養(yang) 的動物細胞。為(wei) 了減輕冷凍的負麵影響，甘油經常被用作冷凍保護劑。許多魚類和昆蟲都會(hui) 產(chan) 生甘油，通過降低細胞的冰點、增強過冷以及防止結冰來抵禦寒冷的溫度。對於(yu) 細菌，添加甘油至終濃度 15% 將有助於(yu) 保持細胞在所有冷凍條件下存活。以下是每個(ge) 冷凍機類別的一些具體(ti) 信息。 

實驗室冷凍櫃可以將溫度降低至 -20 至 -40°C。這些是單級係統（一台壓縮機），通常稱為(wei) 通用冷凍機。細菌可以在通用冰箱中保存中等時間，例如1年。最好使用沒有無霜溫度循環的冰箱，因為(wei) 這會(hui) 對細胞和其他溫度敏感的生物分子造成嚴(yan) 重破壞。通用冰箱價(jia) 格便宜，在大多數實驗室都有，因此它們(men) 很容易用於(yu) 儲(chu) 存培養(yang) 物。缺點是它們(men) 的溫度不夠低，無法長期儲(chu) 存。 

超低溫冰箱是兩(liang) 級係統（兩(liang) 個(ge) 壓縮機，每個(ge) 壓縮機具有不同的製冷劑），可降至 -86°C 左右。超低溫冰箱非常普遍，但其中的空間有時可能有限且競爭(zheng) 激烈。超低溫冰箱的購買(mai) 、運行和維護成本也高得多。好處是，儲(chu) 存在 -80°C 下的細胞往往可以保持存活數年。超低溫冰箱產(chan) 生的較低溫度大大減少了培養(yang) 物內(nei) 的化學反應。然而，冷凍細胞中仍然發生分子運動，因此培養(yang) 物的活力將會(hui) 下降。定期監測培養(yang) 物以評估其生存能力非常重要。   

低溫冷凍櫃非常冷，依靠液氮或專(zhuan) 門的機械係統來運行。對於(yu) 生物樣品，低溫儲(chu) 存應低於(yu) -130°C。在此溫度下，水的分子運動停止，細胞被困在玻璃狀基質中。儲(chu) 存在低溫冰箱中的細菌可以保持其活力多年。在我們(men) 的實驗室中，細菌和酵母培養(yang) 物已在 -140°C 下保存 15 年，活力沒有明顯喪(sang) 失。與(yu) 冷凍幹燥相比，在低溫冰箱中儲(chu) 存細胞是有效且簡單的長期儲(chu) 存方法。其缺點是成本以及庫存對停電、機械故障和液氮交付失敗的潛在脆弱性。此外，管子切勿存放在浸沒液氮的罐中。螺旋蓋管泄漏，會(hui) 將氮氣和汙染物一起吸入管中。液氮氣相冷凍機將有效地避免這個(ge) 問題，但這些冷凍機非常昂貴（高達1萬(wan) 美元）並且需要大量液氮。另一種選擇是機械低溫冷凍機，溫度可低至 -150°C，但購買(mai) 成本也非常昂貴（約 2 萬(wan) 美元）。兩(liang) 台低溫冷凍機的運行費用每月為(wei) 數百美元。但這些冷凍機非常昂貴（高達 1 萬(wan) 美元）並且需要大量液氮。另一種選擇是機械低溫冷凍機，溫度可低至 -150°C，但購買(mai) 成本也非常昂貴（約 2 萬(wan) 美元）。兩(liang) 台低溫冷凍機的運行費用每月為(wei) 數百美元。但這些冷凍機非常昂貴（高達 1 萬(wan) 美元）並且需要大量液氮。另一種選擇是機械低溫冷凍機，溫度可低至 -150°C，但購買(mai) 成本也非常昂貴（約 2 萬(wan) 美元）。兩(liang) 台低溫冷凍機的運行費用每月為(wei) 數百美元。   

冷凍幹燥

在水係統（例如活細胞）中，水不僅(jin) 充當酶促反應的介質，而且還充當自發的負麵反應（例如自由基形成）。除去水會(hui) 停止酶促反應和非酶促反應。冷凍幹燥是去除這種水的一種方法。通過冷凍幹燥可以非常有效地保存許多細菌。通過將細胞冷凍在含有凍幹保護劑（通常是蔗糖）的介質中，然後使用真空吸出水（升華），可以有效保存細胞。這種方法很費力，需要專(zhuan) 門的設備，但它的優(you) 點是可以產(chan) 生不受停電和空液氮罐影響的原種培養(yang) 物。此外，如果培養(yang) 物定期運送到其他實驗室，凍幹培養(yang) 物不需要特殊處理。冷凍幹燥的缺點是並非所有培養(yang) 物都以相同的方式反應，因此需要進行一些實驗來優(you) 化每種菌株的工藝。對於(yu) 任何認真生產(chan) 和維護培養(yang) 物保藏的實驗室，冷凍幹燥應作為(wei) 主要的保存方法。