免疫組織化學 (IHC) – 實驗方案

免疫組織化學是免疫染色在組織學中的重要應用。它需要使用與(yu) 生物組織中的這些抗原結合的抗體(ti) 來特異性檢測細胞中的抗原。組織樣本通過石蠟包埋或福爾馬林固定方法固定，並用抗原修複劑進行預處理。預處理對於(yu) 通過破壞福爾馬林誘導的抗原交聯來改善抗原的表達至關(guan) 重要。然後封閉載玻片以減少背景，並可以通過直接標記或間接測定進行染色。

脫蠟

1. 將載玻片在 60°C 孵育 60 分鍾。

2. 在二甲苯中脫蠟 10 分鍾，然後再重複一次。

3. 在 100% 酒精中水合 5 分鍾，然後在 95% 酒精中水合 5 分鍾，然後在 85% 酒精中水合 5 分鍾，然後在 75% 酒精中水合 5 分鍾。

4. 浸入蒸餾水中5分鍾

5. 浸入 TBS（50 mM Tris、100 mM NaCl、pH 7.6）中，放置 5 分鍾，然後重複兩(liang) 次。

抗原修複

1. 將 500-2000 ml 10 mM 檸檬酸鹽緩衝(chong) 液 (pH6.0) 在不鏽鋼高壓鍋中煮沸。

2. 將載玻片放入染色架中，然後放入高壓鍋中，確保載玻片充分浸入檸檬酸鹽緩衝(chong) 液中。

3. 3-4 分鍾後，當壓力指示閥上升時，孵育 1 分鍾。

4. 將載玻片自然冷卻至室溫。

5. 浸入蒸餾水中，放置 5 分鍾，重複兩(liang) 次。

6. 將載玻片浸入 TBS 中 5 分鍾，然後重複兩(liang) 次。

7. 在室溫下將載玻片浸入 3% H2O2（新鮮甲醇中）15 分鍾。

8. 用蒸餾水清洗兩(liang) 次，每次5分鍾。

9. 用TBS（pH 7.6）洗滌兩(liang) 次，每次5分鍾。

一抗染色

1. 用 TBS 中的 3% BSA 稀釋一抗。用稀釋的一抗覆蓋載玻片上的組織切片（每張載玻片使用 50-150 μl）。

2. 37℃孵育30分鍾或室溫60分鍾（最佳孵育時間、孵育溫度和抗體(ti) 稀釋度應由各個(ge) 實驗室確定）。

3. 用TBS洗滌兩(liang) 次，每次5分鍾。

二抗染色

1. 與(yu) 100-200μl 聚合物增強劑一起孵育 37C 孵育 30 分鍾

2. 用TBS洗滌3次，每次5分鍾。

3. 與(yu) 100 200μl 聚合 HRP 一起孵育，並在 37C 下孵育 30 分鍾

4. 用TBS洗滌3次，每次5分鍾。

5. 加入dAb溶液，孵育3-10分鍾（反應進度和最佳時間應根據顯微鏡確定）。

6. 用蒸餾水清洗2次，每次5分鍾。

7. 如果需要，用蘇木精複染切片，用蒸餾水清洗。將玻片浸入 0.1% HCl 乙醇中 1-10 秒，用蒸餾水清洗。

8. 95%乙醇脫水1分鍾，100%乙醇脫水2×3分鍾，二甲苯脫水2×3分鍾，蓋玻片封固劑。