常見細胞汙染分類和汙染的處理

常見細胞汙染

細胞汙染——培養(yang) 物出現渾濁、混濁。培養(yang) 液pH值升高，液黃。細胞異常的形態，如胞質內(nei) 細菌吞噬體(ti) 。細胞的生長速率減緩，對數生長期變得不規律。異常的細胞死亡或細胞溶解情況。

真菌汙染——培養(yang) 液可能出現異味。培養(yang) 皿內(nei) 有異常的顏色、紋理或斑點。細胞顯示出不正常的細胞形態，如真菌吞噬體(ti) 或真菌絲(si) 狀體(ti) 。細胞的生長速率可能受到抑製，細胞數量不斷減少。

支原體(ti) 汙染——支原體(ti) 汙染通常不會(hui) 導致明顯的細胞培養(yang) 液變化。因此，支原體(ti) 汙染通常需要PCR或DNA雜交來檢測。可能出現感染跡象，如出現包涵體(ti) 或囊泡。細胞的生長速率減緩。

常見汙染處理

因汙染會(hui) 改變細胞表型，在細胞種子充足及排除汙染因素的情況下，首先丟(diu) 棄汙染細胞，重新複蘇。

在未檢測的情況下沿用當前細胞試劑及耗材可能導致汙染擴散，應及時滅菌或丟(diu) 棄。

如果懷疑細胞培養(yang) 受到汙染，應立即采取行動來確認並解決(jue) 問題。常見的處理方法包括：

1.隔離：將受汙染的培養(yang) 物隔離，並最後處理汙染細胞，以防止汙染蔓延到其他培養(yang) 物中。

2.汙染源排除：查找和消除汙染的來源，可使用無抗LB搖菌培養(yang) 或汙染檢測試劑。

3.更換培養(yang) 液：將受汙染的培養(yang) 液更換為(wei) 新的培養(yang) 液，細菌汙染添加敏感抗生素如氨苄青黴素，真菌添加兩(liang) 性黴素B，支原體(ti) 添加氧氟沙星以控製汙染。

4.細胞重新傳(chuan) 代：如有必要，將細胞重新傳(chuan) 代到新的培養(yang) 皿中，離心速度低於(yu) 平時，200-300g。

5.汙染檢測：進行汙染檢測，以確認汙染的類型和程度，從(cong) 而采取適當的措施。

操作手冊(ce)

● 原代細胞提取

● 血清更換注意事項及步驟

● 血清儲(chu) 存及化凍

● 持續更新中

原代細胞提取-1

固體(ti) 組織樣品（肝，肺，腫瘤等）

1.分離組織後立即移入超淨台操作（＜20min)，或放入組織保存液中四度保存（不超過48h)。

注意：以下步驟均需無菌操作，且保持低溫！

2.取一無菌小皿，加入3ml預冷的PBS，放入組織清洗。重複此步驟一次。

3.用無菌剪和無菌鑷（高溫高壓滅菌）去除脂肪或壞死區域等非目標組織。

4.轉移組織塊至一無菌15ml/50ml離心管中，加入組織體(ti) 積10倍的advanced DMEM/F12培養(yang) 基（緩衝(chong) 液可自行調整，與(yu) 後續培養(yang) 體(ti) 係一致）。離心管置於(yu) 冰上，用無菌剪將組織剪成肉泥狀。（此步驟注意低溫）

5.四度600g離心5分鍾，去上清，加入消化液（浸沒組織），37℃搖床（800rpm)消化15min，視解離狀態調整消化時間，一般不超過45min。（消化液需視組織類型自行調整。一般組成為(wei) 膠原酶1和4，濃度為(wei) 400-1000U/ml，以及核酸酶5-20U/ml，可選擇添加10uM ROCK抑製劑以提高組織活率。）

原代細胞提取-2

6.消化結束立即冰上，加入體(ti) 積6%的血清終止消化，四度離心棄上清，用巴氏管吸取1-2ml全培養(yang) 基重懸後細胞濾網過濾，根據後續目的和細胞類型選擇濾網大小（類器官需要細胞團一般選擇較大的100um，建庫的單細胞懸液一般選擇70um或更小）。

7.視上一步沉澱顏色選擇是否裂紅，裂紅至沉澱無明顯紅色即可。裂紅液現配，至少10ml，常溫避光裂紅10min。

8.用巴氏管充分混勻細胞懸液，吸取10ul細胞懸液與(yu) 2x台盼藍混勻後計數板計數。一般細胞活性＞85%為(wei) 達標。如不達標，則低速(200-300g)四度離心後棄上清，重懸，再次計數和測量活性，直至達標。）

9.計算所需細胞數量並進行下一步操作，直接種板培養(yang) ，點膠，或上機等。

液體(ti) 樣品（血液，胸水，腹水等）

1.直接600g四度離心5min後棄上清，用medium重懸清洗兩(liang) 次。

2.過濾可選，直接進入裂紅判斷步驟

3.後續步驟同上。