DNAstorm™ FFPE 套件常見問題

使用 DNAstorm™ 試劑盒獲得的 DNA 中是否存在汙染 RNA？

通過在裂解步驟後立即執行優(you) 化的 RNase 消化步驟來消除 RNA 汙染。

我預計可以從 FFPE 樣本中獲得多少 DNA？

影響獲得的 DNA 總量的最大變量是樣本本身的質量（即組織的類型和數量，以及樣本分離和保存的注意事項）。使用 DNAstorm™ 試劑盒，並假設樣品質量至少合理，可以獲得大於(yu) 1 µg 的量。

使用 DNAstorm™ 試劑盒獲得的 DNA 可以用於下一代測序嗎？

是的。隻要 DNA 的質量足夠高，就可以獲得高質量的文庫。

組織應該如何準備？

使用切片機從(cong) FFPE 樣品中獲取 5-10 µm 的切片。如果可以可靠地切割，可以使用小於(yu) 5 µm 的切片。不建議使用厚度超過 10 µm 的切片，因為(wei) 它們(men) 可能無法全消化。

我可以使用非石蠟包埋的組織嗎？

是的，可以使用未包埋在石蠟中的組織。在這種情況下，我們(men) 建議機械研磨相當於(yu) 推薦切片數量的組織。

我可以使用 FFPE 芯嗎？

是的，可以使用 FFPE 芯材。由於(yu) 核心不使用切片機進行處理，因此樣品消化往往更加困難，如果觀察到消化不全，建議使用機械均質化（例如使用鋼珠）。

您推薦哪種脫蠟方法？

DNAstorm™ 試劑盒包含推薦的脫蠟試劑。與(yu) 其他常見方法（例如二甲苯）不同，脫蠟試劑高效、無毒，並且不需要使用通風櫃。在我們(men) 的測試中，所包含的試劑在去除石蠟和純化高質量核酸方麵至少與(yu) 二甲苯一樣有效。

將脫蠟試劑與 CAT5 裂解緩衝液混合後，我看到脫蠟試劑層和水層之間有白色混濁層。這是什麽以及它如何影響提取？

白色混濁層是脫蠟試劑和 CAT5 裂解緩衝(chong) 液之間的乳液，當這兩(liang) 種試劑渦旋或硬混時可能會(hui) 形成。為(wei) 避免此問題，我們(men) 建議在脫蠟試劑和 CAT5 裂解緩衝(chong) 液接觸時不要渦旋樣品。當需要在這兩(liang) 種試劑存在的情況下混合時（例如添加蛋白酶時），我們(men) 建議使用移液器混合。通過以最大速度 (> 16,000 xg) 強力旋轉樣品至少 2 分鍾，可以去除白色渾濁層。時間長短取決(jue) 於(yu) 乳液的體(ti) 積。

如何評估我獲得的 DNA 的完整性？

由於(yu) 從(cong) FFPE 組織樣品中分離出的 DNA 尺寸分布廣泛，我們(men) 建議使用脈衝(chong) 場凝膠電泳 (PFGE)。也可以使用基於(yu) 毛細管電泳的方法，例如安捷倫(lun) 生物分析儀(yi) ，但可能無法正確解析質量較好的樣品中的高分子量片段（大於(yu) 10k）。

為什麽我提取的 DNA 無法正常擴增？我注意到很多 PCR 抑製和/或 Ct 值毫無意義。

當使用大量 FFPE 提取的模板 DNA 時，經常會(hui) 觀察到 PCR 抑製。這種抑製通常不是由於(yu) 汙染物的存在，而是由於(yu) DNA 本身的殘留化學修飾和損傷(shang) 造成的。對 PCR 方案進行一些簡單的調整就可以解決(jue) 這個(ge) 問題。首先，應減少模板DNA的量。其次，PCR 聚合酶的量應增加 2-4 倍。第三，應延長退火和延伸時間。第四，可以增加dNTP的量。