RNAstorm™ FFPE 套件常見問題

使用 RNAstorm™ 試劑盒獲得的 RNA 中是否存在任何汙染的基因組 DNA？

基因組 DNA 的汙染是一個(ge) 大問題，因為(wei) 它會(hui) 幹擾下遊應用。 RNAstorm™ 試劑盒包括優(you) 化的 DNase 消化步驟，可去除汙染的基因組 DNA，而不顯著影響 RNA 產(chan) 量。雖然此步驟是可選的，但強烈建議這樣做。

我期望從 FFPE 樣品中獲得多少 RNA？

影響獲得的RNA總量的最大變量是樣品本身的質量（即組織的類型和數量，以及樣品分離和保存的注意事項）。使用 RNAstorm™ 試劑盒，並假設至少合理的樣品質量，可以獲得大於(yu) 1 µg 的量。

使用RNAstorm™試劑盒獲得的RNA可以用於RNA-Seq嗎？

是的。隻要 RNA 的質量足夠高，就可以獲得高質量的文庫。對於(yu) Illumina 測序，建議 DV200 至少為(wei) 30%，並且應使用提供至少 1 µg RNA 的樣品。

組織應該如何準備？

使用切片機從(cong) FFPE 樣品中獲取 5-10 µm 的切片。如果可以可靠地切割，可以使用小於(yu) 5 µm 的切片。不建議使用厚度超過 10 µm 的切片，因為(wei) 它們(men) 可能無法全消化。此外，每次提取應使用不超過 5 個(ge) 切片（每個(ge) 10 µM）。使用過多的組織會(hui) 導致消化不全並降低產(chan) 量。

我可以使用非石蠟包埋的組織嗎？

是的，可以使用未包埋在石蠟中的組織。在這種情況下，我們(men) 建議機械研磨相當於(yu) 推薦切片數量的組織。

我可以使用 FFPE 芯嗎？

是的，可以使用 FFPE 芯材。由於(yu) 核心不使用切片機進行處理，因此樣品消化往往更加困難，如果觀察到消化不全，建議使用機械均質化（例如使用鋼珠）。

您推薦哪種脫蠟方法？

RNAstorm™ 試劑盒包含推薦的脫蠟試劑。與(yu) 其他常見方法（例如二甲苯）不同，脫蠟試劑高效、無毒，並且不需要使用通風櫃。在我們(men) 的測試中，所包含的試劑在去除石蠟和純化高質量核酸方麵至少與(yu) 二甲苯一樣有效。

定量從 FFPE 樣品中獲得的 RNA 的最佳方法是什麽？

與(yu) 從(cong) 新鮮樣品中獲得的 RNA 相比，準確定量 FFPE 衍生的 RNA 更具挑戰性。僅(jin) 僅(jin) 知道存在的 RNA 的絕對量是不夠的，還要知道 RNA 是否會(hui) 在下遊應用中發揮作用，這取決(jue) 於(yu) 以下因素：

• 片段大小分布：如果 5 µg 樣品（通過 Qubit 測量）包含 < 200 nt 的片段，則它對於(yu) RNA-Seq 可能毫無用處。

• 化學修飾：對於(yu) 從(cong) 福爾馬林固定的樣品中獲得的RNA，各種化學加合物和交聯，包括堿基修飾、堿基-堿基交聯和堿基-蛋白質交聯，可以使核酸分子無法被酶接觸，從(cong) 而在下遊應用中失活。

• 汙染：純化過程中使用的細胞碎片、蛋白質、鹽和洗滌劑可能會(hui) 導致下遊檢測產(chan) 生偏差。例如，Nanodrop 等基於(yu) UV/Vis 的方法特別容易受到 200-280 nm 範圍內(nei) 吸收的汙染物的影響。

• 基於(yu) 熒光的方法（例如 Qubit）容易出現重大錯誤。當使用低濃度的 DNA 或 RNA 時，基於(yu) 染料的檢測可能不是線性的。還必須注意 RNA 樣品中基因組 DNA 的汙染，因為(wei) 用於(yu) 熒光定量的染料並不全針對 FFPE 衍生的 DNA 或 RNA。

• 定量 PCR 是定量嚴(yan) 重受損和修飾核酸的方法。

是否應該使用 RIN 編號來確定 FFPE 衍生 RNA 的質量？

盡管 RIN 數可以提供有關(guan) 樣品碎片程度的一般信息，但它不夠靈敏或可預測，不足以成為(wei) 下遊性能的有用指標，尤其是對於(yu) RNA-Seq。通常，FFPE 衍生 RNA 的 RIN 編號在 2 到 3 之間。其中一些樣本對 RNA-Seq 有用，而另一些則不會(hui) ——但是，RIN 不會(hui) 告訴您。

使用 Illumina 測序的 RNA-Seq性能預測指標稍好一些的是 DV200，它代表長度超過 200 個(ge) 核苷酸的 RNA 片段的百分比。 DV200 也是基於(yu) 生物分析儀(yi) 數據計算的，但與(yu) 所有基於(yu) 生物分析儀(yi) 的方法具有相同的缺點，特別是高變異性。

從 FFPE 樣品中提取 RNA 時我需要了解什麽？

• 避免基於(yu) 有機溶劑 (Trizol) 的方法

• 避免刺激性離液鹽（即胍鹽）

• 避免使用影響 UV 和/或 Qubit 下遊定量的清潔劑（例如 Triton X-100）

• 請勿依賴 RIN 來定量 FFPE 衍生樣品的完整性。看看為(wei) 什麽(me) 。請改用 DV200。

• 使用去除福爾馬林化學修飾的試劑盒或方法。請勿將溫度升至 80°C 或以上。即使在此溫度下停留很短的時間也會(hui) 顯著降低完整性。

• 請警惕 Qubit 和 Nanodrop 濃度，因為(wei) 可能會(hui) 受到有機分子或 DNA 汙染。

• 使用 qPCR 定量 RNA，並始終仔細觀察熔解曲線以確定是否發生非特異性擴增。