免疫測定的方法有哪些？

利用抗原和抗體(ti) 的特異性結合特性，通過免疫分析技術可以對細胞因子進行定量或定性檢測。盡管細胞因子的種類很多，但隻要獲得針對細胞因子的特異性抗體(ti) （包括多克隆或單克隆抗體(ti) ），就可以采用免疫分析法進行檢測。常用的方法包括ELISA、RIA、Western blotting、免疫熒光以及基於(yu) 免疫熒光技術的流式細胞術分析。

1. 酶聯免疫吸附法

ELISA是應用廣泛的異質酶標記免疫分析技術。一步或多步抗原抗體(ti) 反應和一步酶促反應構成了ELISA的基本步驟，可用於(yu) 定性或定量分析。雙抗體(ti) 夾心法是細胞因子測定常用的方法。該方法中使用的抗體(ti) 可以是針對同一抗原的多克隆抗體(ti) 或針對同一抗原的不同表位的單克隆抗體(ti) 。

細胞因子測定的標本主要包括兩(liang) 類，一類是血清（血漿）、滑液、胸水、腦脊液或腹膜液等體(ti) 液，可用於(yu) 細胞因子和可溶性粘附分子的檢測；另一種是體(ti) 外培養(yang) 後的細胞培養(yang) 。上清液僅(jin) 用於(yu) 細胞因子的檢測。

ELISA方法具有特異性強、簡便、易於(yu) 推廣和標準化等優(you) 點。此外，該方法還可以檢測無生物活性的細胞因子前體(ti) 、分解片段以及與(yu) 相應受體(ti) 的綴合物。缺點是靈敏度較低，無法判斷細胞因子的生物活性。

2. 流式細胞儀

流式細胞術是一種基於(yu) 熒光抗體(ti) 染色技術和流式細胞術靈敏分辨率的方法。該方法主要用於(yu) 細胞內(nei) 細胞因子和細胞表麵粘附分子的檢測。通過特異性熒光抗體(ti) 染色，可以簡單快速地進行單細胞水平的細胞因子或粘附因子的檢測，並且可以準確確定不同細胞亞(ya) 群的檢測。細胞因子和膜分子的表達。根據熒光抗體(ti) 的性質，熒光抗體(ti) 染色可分為(wei) 直接法和間接法。前者使用熒光標記的細胞因子或粘附分子的特異性抗體(ti) ，而後者則使用熒光標記的二抗。直接法較為(wei) 常用，雖然其靈敏度不如間接法，但特異性強。

該方法檢測細胞內(nei) 細胞因子時，主要包括以下基本步驟：

1. 待測細胞的分離和培養(yang)

2. 細胞固定常用的細胞固定液為(wei) 4%多聚甲醛。

3. 封閉非特異性結合位點 用含有 5% 脫脂奶粉和鈣、鎂離子的 PBS 溶液重懸固定的細胞。

4.染色與(yu) 分析采用熒光素標記的細胞因子特異性單克隆抗體(ti) 進行熒光抗體(ti) 染色，流式細胞儀(yi) 分析熒光陽性細胞百分率和熒光強度。另外，如果使用兩(liang) 種或多種細胞因子的不同熒光素標記的單克隆抗體(ti) ，則可以同時檢測同一細胞中兩(liang) 種或多種不同的細胞因子。

該方法還可用於(yu) 區分具有不同分泌特性的細胞亞(ya) 群，例如 Th1 和 Th2 細胞。

3.酶聯免疫斑點法

酶聯免疫斑點試驗（ELISPOT），源自ELISA，但突破了傳(chuan) 統ELISA，是抗體(ti) 形成細胞定量測定的延伸和發展，已越來越多地應用於(yu) 類風濕因子、IFN-γ等細胞因子的定量測定的分泌細胞。

ELISPOT優(you) 於(yu) 傳(chuan) 統的抗體(ti) 、細胞因子或其他可溶性分子分泌細胞檢測方法，可以檢測20萬(wan) 至30萬(wan) 個(ge) 細胞中1個(ge) 分泌相應分子的細胞。如果引入生物素和親(qin) 和素係統，則很敏感。做ELISPOT時，所選的特異性抗體(ti) 應具有高親(qin) 和力、高特異性、低內(nei) 毒素的特點。所選的細胞激活劑不得影響細胞的分泌功能。

4. 免疫測定的方法學評價(jia)
免疫測定可用於(yu) 檢測幾乎所有細胞因子。與(yu) 生物活性測定相比，主要優(you) 點和缺點是：

優(you) 點：①特異性高，使用特異性單克隆抗體(ti) 可用於(yu) 單一細胞因子的檢測； ②操作簡單、快速，不需要依賴細胞係，因此不需要維持培養(yang) ，大大增加了方法的可操作性，易於(yu) 普及，便於(yu) 普查； ③影響因素相對較少且易於(yu) 控製，重複性好，方法易於(yu) 標準化。

缺點：①測量的隻是細胞因子的蛋白質含量，與(yu) 其生物活性不一定成正比； ②測定結果與(yu) 所用抗體(ti) 的來源和親(qin) 和力有很大關(guan) 係。當使用具有不同親(qin) 和力的mAb時，檢測到相同的樣品。結果可能會(hui) 有所不同； ③靈敏度較低，比生物活性法低10～100倍左右，測定下限一般為(wei) 100pg； ④ 如果樣品中存在可溶性細胞因子受體(ti) ，可能會(hui) 影響細胞因子特異性抗體(ti) 的結合。

除了上述方法外，分子生物學技術（也是生物測定方法）也廣泛應用於(yu) 細胞因子或粘附分子的檢測，例如PCR/RT-PCR、斑點印跡、Northern-blot和FISH。細胞或組織原位雜交等

其他免疫分析：偏振熒光檢測技術；使用共焦激光顯微鏡；發光技術；免疫組織化學染色。這些方法在粘附分子、細胞因子及其分泌細胞的檢測中發揮著積極的作用。