鮑曼不動杆菌基因組DNA簡述

傳(chuan) 代方法

使用前請先在緩衝(chong) 液GD和漂洗液PW中加入無水乙醇，加入體(ti) 積請參照瓶上的標簽； 1.取細菌培養(yang) 液1-5ml，10,000rpm(11,500×g)離心1min，盡量吸淨上清； 2.向菌體(ti) 沉澱中加入200μL緩衝(chong) 液GA，振蕩至菌體(ti) 徹di懸浮。注意：對於(yu) 較難破壁的革蘭(lan) 氏陽性菌，可略過第2步驟，加入溶菌酶溶液進行破壁處理，具體(ti) 方法為(wei) ：加入110μL緩衝(chong) 液（20mM Tris,pH8.0；2mM Na2-EDTA；1.2%Triton），和70μL溶菌酶溶液（50mg/mL，客戶自備，目錄號：RT401），37℃處理30min以上。如果需要去除RNA，可加入4μL RNase A（100mg/mL）溶液（客戶自備，目錄號：RT405-12），振蕩15sec，室溫放置5min； 3.向管中加入20μL Proteinase K溶液，混勻； 4.加入220μL緩衝(chong) 液GB，振蕩15sec，70℃放置10min，溶液應變清亮，簡短離心以去除管蓋內(nei) 壁的水珠。注意：加入緩衝(chong) 液GB時可能會(hui) 產(chan) 生白色沉澱，一般70℃放置時會(hui) 消失，不會(hui) 影響後續實驗。如溶液未變清亮，說明細胞裂解不徹di，可能導致提取DNA量少和提取出的DNA不純； 5.加220μL無水乙醇，充分振蕩混勻15sec，此時可能會(hui) 出現絮狀沉澱，簡短離心以去除管蓋內(nei) 壁的水珠； 6.將上一步所得溶液和絮狀沉澱都加入一個(ge) 吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），12,000rpm(13,400×g)離心30sec，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中； 7.向吸附柱CB3中加入500μL緩衝(chong) 液GD（使用前請先檢查是否已加入無水乙醇），12,000rpm(13,400×g)離心30sec，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中； 8.向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW（使用前請先檢查是否已加入無水乙醇），12,000rpm(13,400×g)離心30sec，倒掉廢液，吸附柱CB3放入收集管中； 9.重複操作步驟8； 10.將吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm(13,400×g)離心2min，倒掉廢液。將吸附柱CB3置於(yu) 室溫放置數分鍾，以徹di晾幹吸附材料中殘餘(yu) 的漂洗液。注意：這一步的目的是將吸附柱中殘餘(yu) 的漂洗液去除，漂洗液中乙醇的殘留會(hui) 影響後續的酶反應（酶切、PCR等）實驗； 11.將吸附柱CB3轉入一個(ge) 幹淨的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50-200μL洗脫緩衝(chong) 液TE，室溫放置2-5min，12,000rpm(13,400×g)離心2min，將溶液收集到離心管中。注意：洗脫緩衝(chong) 液體(ti) 積不應少於(yu) 50μL，體(ti) 積過小影響回收效率。洗脫液的pH值對於(yu) 洗脫效率有很大影響。若用ddH2O做洗脫液應保證其pH值在7.0-8.5範圍內(nei) ，pH值低於(yu) 7.0會(hui) 降低洗脫效率；且DNA產(chan) 物應保存在-20℃，以防DNA降解。為(wei) 增加基因組DNA的得率，可將離心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，室溫放置2min，12,000rpm(13,400×g)離心2min；

生長條件

37℃；18-24h；好氧；

存儲(chu) 條件

2-8℃