Nanogold®-鏈黴親和素原位雜交

1.4 nm Nanogold® 金納米粒子探針 體(ti) 積小，不聚集，因此能夠接觸核抗原，這使得它們(men) 成為(wei) 超靈敏原位雜交檢測特定 DNA 序列（無論是否使用原位PCR）的優(you) 秀試劑。

內容

• Nanogold®-鏈黴親(qin) 和素原位雜交

• Nanogold®-Silver原位雜交與(yu) “CARD"係統

• 使用 Nanogold®-Silver原位雜交與(yu) “CARD"係統進行 RNA 檢測

• 使用 Nanogold®-鏈黴親(qin) 和素-銀進行免疫標記來檢測針對單克隆一抗的生物素化二抗

優點

• 結合標簽擴增單基因拷貝分辨率，比 NBT-BCIP 堿性磷酸酶或過氧化物酶更靈敏。

• 大多數情況下不需要更冗長的 PCR 程序。

• 避免由於(yu) 錯誤引發和擴增子擴散而導致 PCR 出現假陽性。

• 使用標準明場顯微鏡可輕鬆看到黑色；不需要昂貴的熒光光學器件，也沒有自發熒光和漂白信號丟(diu) 失的問題。

• 黑色與(yu) 全強度標準細胞和核染色劑（H＆E、核固紅、甲基綠）兼容，極大地改善了形態學評估。

• 也可用於(yu) EM 研究。

單獨給出了 Nanogold®-鏈黴親(qin) 和素原位雜交的完整方案，無論是否有 CARD 係統。

Nanogold®-鏈黴親 和素原位雜交

© 伊頓出版公司；經許可使用。

圖 1：納米金-銀原位雜交技術的示意圖。通過與(yu) 生物素標記的 cDNA 探針雜交來檢測宿主細胞中的 DNA 序列。然後使用鏈黴親(qin) 和素-Nanogold 檢測與(yu) 間隔臂共價(jia) 結合的生物素，並隨後使用乙酸銀或乳酸銀自動金相術進行銀增強。為(wei) 簡單起見，僅(jin) 顯示了四種此類生物素和鏈黴親(qin) 和素-Nanogold 分子。 Hacker, GW、Hauser-Kronberger, C.、Zehbe, I.、Su, H.、Schiechl, A.、Dietze, O. 和 Tubbs, R.；細胞視覺， 4，54-65（1997）。

 

 

使用該方法檢測人乳頭瘤病毒6/11型基因組如下所示；可以看出，Nanogold®-銀染色產生濃密的黑色信號，在許多情況下比使用傳統酶底物獲得的信號更清晰。

納米金銀 ISH 檢測尖銳濕疣中的 HPV 6/11。在這種情況下，獲得了強標記。大多數感染的細胞核呈致密黑色或顆粒狀黑色染色。一些細胞核還顯示出單個(ge) 黑點標記，表明這種 DNA 病毒的拷貝數非常低。染色如方案中所述；福爾馬林固定、7 微米厚的石蠟切片，用蘇木精和伊紅複染。放大倍數，X 285。

Nanogold®-Silver原位雜交與“CARD"係統

CARD - 催化報告沉積（也稱為(wei) TSA® 或酪酰胺信號放大；可從(cong) NEN Life Sciences獲得的試劑盒） - 是一種係統，其中鏈黴親(qin) 和素連接的過氧化物酶分子用於(yu) 在感興(xing) 趣的位點催化積累生物素化的酪酰胺。這在使用 Nanogold®-鏈黴親(qin) 和素和銀增強進行檢測之前，在程序中插入了額外的擴增步驟；結果是靈敏度大幅提高，從(cong) 而可以檢測單拷貝基因，而不會(hui) 遇到 PCR 相關(guan) 的困難。

圖2：CARD-納米金-銀 原位雜交技術的示意圖。通過與(yu) FITC 標記的核糖核酸探針雜交來檢測宿主細胞中的 RNA 序列。然後針對 FITC 的第一抗體(ti) 層與(yu) 用作核酸報道分子的 FITC 分子結合。下一層是針對提供一抗的物種 IgG 的二抗，用生物素標記。為(wei) 了簡單起見，僅(jin) 顯示了這兩(liang) 種抗體(ti) 中的每一種。然後生物素與(yu) 鏈黴親(qin) 和素-生物素-過氧化物酶（S-ABC-過氧化物酶）複合物結合。顯示了四個(ge) 這樣的分子，每個(ge) 分子都攜帶過氧化物酶。然後，這些過氧化物酶分子催化生物素化酪酰胺的積累（催化報告沉積），最終導致生物素標記的“倍增"。作為(wei) 最後一層，鏈黴親(qin) 和素-Nanogold隨後使用醋酸銀或乳酸銀放大（自動金相學）。這些最終的鏈黴親(qin) 和素分子中的每一個(ge) 都可以檢測許多生物素分子中的一個(ge) 。通過這種方式，可以實現巨大的擴增，在許多情況下無需 PCR 或 3SR 技術即可實現單基因拷貝敏感性。

Hacker, GW、Hauser-Kronberger, C.、Zehbe, I.、Su, H.、Schiechl, A.、Dietze, O. 和 Tubbs, R.；細胞視覺， 4，54-65（1997）。

© 伊頓出版公司；經許可使用。

該程序用於(yu) 檢測宮頸癌標本培養(yang) 的 SiHa 細胞中的 HPV-16（一種 cDNA 病毒）。已知這些細胞僅(jin) 含有一到幾個(ge) 病毒 DNA 拷貝； Nanogold®-鏈黴親(qin) 和素原位雜交與(yu) CARD 結合產(chan) 生細胞核的致密黑色顆粒染色；黑色信號比過氧化物酶-鏈黴親(qin) 和素產(chan) 生的信號更容易區分。該程序可能會(hui) 在 5 至 7 小時內(nei) 完成；

通過 CARD 擴增的納米金銀ISH 檢測到 SiHa 細胞中 HPV 16 的單拷貝。這種源自宮頸癌的細胞係僅(jin) 含有一到幾個(ge) HPV 16 拷貝，通過所應用的技術顯示為(wei) 單個(ge) 斑點（詳細信息請參閱實驗方案）。細胞離心塗片製備，用核固紅複染。在福爾馬林固定石蠟材料的組織切片中獲得了類似的染色(Zehbe等人，Am.J.Pathol.150 , 1553-1561(1997))。原始放大倍數，X 560。

使用 Nanogold®-Silver原位雜交與“CARD"係統進行 RNA 檢測

RNA的檢測具有同樣高的靈敏度，如下圖：

霍奇金病中的 Epstein-Barr 病毒；使用RNA 檢測方案進行高靈敏度檢測的示例。原始放大倍數，X 400。

使用 Nanogold®-鏈黴親和素-銀進行免疫標記來檢測針對單克隆一抗的生物素化二抗

Nanogold®-鏈黴親(qin) 和素在免疫標記實驗中也能發揮良好作用。下麵顯示了一個(ge) 例子，其中它用作針對針對單克隆一抗的生物素化多克隆二抗的三級探針，以探測乳腺癌抗原。

使用間接 Nanogold® 標記檢測 Ki-67 乳腺癌抗原。使用一抗和生物素化山羊抗小鼠二抗檢測 Ki-67 抗原；使用 Nanogold®-鏈黴抗生物素蛋白（250 倍稀釋）和自動金相學對其進行可視化。原始放大倍數，X 400。