轉染試劑的比較：siRNA 和 DNA

介紹

體(ti) 外 轉染過程 涉及將遺傳(chuan) 物質引入細胞，通常通過非病毒方法用於(yu) 哺乳動物細胞 [1]。各種治療性貨物分子可用於(yu) 細胞內(nei) 遞送至癌細胞係和原代細胞，包括質粒 DNA (pDNA)、蛋白質、小分子、信使 RNA (mRNA) 和RNA，例如短幹擾 RNA ( siRNA ) 和微小 RNA (miRNA) ) [2]。Altogen Biosesystems 通過將組合化學、分子生物學和細胞生物學方麵的專(zhuan) 業(ye) 知識應用於(yu) 轉染技術的開發，為(wei) 特定細胞係開發優(you) 化的轉染技術。

自 1950 年代以來，轉染一直在使用，並且仍然是細胞生物學研究中的重要元素，其技術範圍從(cong) 物理技術（如電穿孔）到使用磷酸鈣的化學介導轉染，甚至脂質體(ti) 轉染技術 [3]。在脂質體(ti) 轉染中，遺傳(chuan) 物質包含在脂質體(ti) 中通過將材料與(yu) 陽離子脂質混合，脂質體(ti) 將其“貨物"沉積到靶細胞中。可以針對目標細胞係優(you) 化轉染試劑，也可以定製轉染方案。最近出現了幾種先進的方法，例如基於(yu) 脂質和聚合物的載體(ti) 分子。這些化合物能夠產(chan) 生脂質體(ti) ，脂質體(ti) 可以與(yu) 細胞膜融合，以便將結合的 RNA 或 DNA 遞送至細胞。

轉染：作用機製

體(ti) 外 轉染是將外源分子和遺傳(chuan) 物質、DNA或 RNA 瞬時或穩定地引入培養(yang) 的哺乳動物細胞中。盡管轉染技術存在方法學多樣性，但化學轉染是當前實驗室研究中使用的技術。使用的轉染試劑含有陽離子脂質，有助於(yu) 將 DNA 和 siRNA 遞送到細胞中 [4]；雖然陽離子聚合物是最早使用的化學品之一，但陽離子脂質現在是當今使用廣泛的化學品。化學轉染背後的科學原理保持不變，它基於(yu) 載貨分子與(yu) 細胞膜脂質雙層之間的靜電相互作用. 基本上，帶負電荷的遺傳(chuan) 物質與(yu) 帶正電荷的試劑結合，使遺傳(chuan) 物質能夠穿過細胞膜，從(cong) 而通過內(nei) 吞作用發生細胞攝取。在細胞內(nei) 部，轉染複合物可用於(yu) 多種目的。如果 DNA 被轉染，則穩定表達需要它進入細胞核，從(cong) 而導致基因表達 [5]。可能影響特定化學選擇的因素取決(jue) 於(yu) 轉染的遺傳(chuan) 物質，但 pH 值、細胞類型以及遺傳(chuan) 物質與(yu) 試劑的比例等因素對於(yu) 正確的實驗設置至關(guan) 重要。

轉染方法

將 DNA 和 RNA 引入培養(yang) 的哺乳動物細胞可能需要不同的轉染方法，具體(ti) 取決(jue) 於(yu) 特定的細胞係和最終目標。此類方法包括脂質體(ti) 介導的轉染、非脂質體(ti) 轉染劑（脂質和聚合物）、基於(yu) 樹枝狀聚合物的轉染、電穿孔、顯微注射、病毒介導的基因遞送、RNA 幹擾 (RNAi)、siRNA 轉染、高通量 siRNA 篩選和基因沉默 (RNAi) [6, 7, 8]。

轉染試劑

對於(yu) 化學轉染實驗來說，保持細胞活力極為(wei) 重要；如果細胞因用於(yu) 轉染的有毒化學品而死亡，則實驗結束。轉染試劑之所以眾(zhong) 多，正是因為(wei) 某些細胞類型需要更溫和的條件或特殊添加劑來防止細胞毒性。就此而言，Altogen Biosesystems 提供了專(zhuan) 為(wei) 特定細胞係設計的種類齊全的試劑，專(zhuan) 門設計用於(yu) 提高轉染效率，同時防止細胞死亡。

轉染試劑本身由專(zhuan) 門針對特定細胞類型優(you) 化的緩衝(chong) 液配方組成。在某些情況下，轉染試劑可包括旨在幫助所需化合物進入細胞的分子。例如，脂質體(ti) 轉染試劑將包括脂質體(ti) 鏈，其封裝給定的核酸序列並允許其被細胞內(nei) 吞。另一個(ge) 例子是用納米粒子製成的轉染試劑，它可以結合所需的序列並幫助它們(men) 穿過細胞膜。

與(yu) 所需貨物結合的轉染試劑和影響細胞膜的轉染試劑之間應該有一個(ge) 重要的區別。例如，電穿孔緩衝(chong) 液是一種轉染試劑，它允許細胞膜變得可滲透，從(cong) 而允許外來顆粒進入細胞。然而，電穿孔緩衝(chong) 液不封裝核酸序列，因此電穿孔實驗必須依賴轉染化合物的獨立穩定性。

體(ti) 外 轉染研究

Altogen Biosesystems 提供針對不同細胞係優(you) 化的不同體(ti) 外轉染試劑，例如 A549 細胞（肺癌）、DU145 細胞（前列腺癌）、MCF-7 細胞（乳腺癌）和 HepG2 細胞（肝細胞癌）。以下是使用  細胞係特異性體(ti) 外轉染試劑進行的幾項研究的數據匯編。

A549細胞轉染試劑（肺癌細胞，CCL-185）

圖 1.按照推薦方案轉染靶向 Lamin A/C mRNA 或非沉默對照 siRNA 的 siRNA。在轉染後 48 小時，通過 qRT-PCR 分析 A549 細胞的基因表達水平。18S rRNA 水平用於(yu) 標準化 Lamin A/C 數據。將值歸一化為(wei) 未處理的樣品。數據為(wei) 平均值±SD (n=3)。

• 雙組分製劑提高了脂質介導的轉染效率，

• 為(wei) RNA 和 DNA 的轉染提供了優(you) 化的易於(yu) 使用的轉染方案

• 血清存在下的高轉染效率

• 適用於(yu) 標準反向轉染和高通量應用。

• 試劑表現出至少 80% 的 siRNA 轉染效率。轉染效率通過實時RT-PCR確定。

圖 2. Lamin A/C 在 A549 細胞中的蛋白質表達。按照 Altogen Biosesystems 轉染方案，將表達 Lamin A/C 或靶向 Lamin A/C 的 siRNA 的 DNA 質粒轉染到 A549 細胞中。在轉染後 72 小時，通過蛋白質印跡分析細胞的蛋白質表達水平（通過總蛋白質標準化，每孔加載 10 µg 總蛋白質）。未處理的細胞用作陰性對照。

DU145 細胞（前列腺癌細胞，HTB-81）轉染試劑

圖 3.按照推薦方案將靶向 Lamin A/C mRNA 或非沉默對照 siRNA 的 siRNA 轉染到 DU-145 細胞中。在轉染後 48 小時，通過 qRT-PCR 分析細胞的 Lamin A/C 基因表達水平。18S rRNA 水平用於(yu) 標準化 Lamin A/C 數據。將值歸一化為(wei) 未處理的樣品。數據為(wei) 平均值±SD (n=4)。

• 專(zhuan) 有陽離子脂質配方

• 小RNA（siRNA、shRNA、miRNA）、mRNA、pDNA的高轉染效率

• 產(chan) 生一致的結果，批次到批次、板到板和孔到孔

• 一種經過驗證的用於(yu) 建立穩定細胞係的試劑

• 優(you) 化的轉染方案適用於(yu) 標準和反向轉染方法。

• 有效且穩健的細胞內(nei) 遞送

• 試劑盒包括轉染增強劑試劑

• 在血清存在下工作

• 試劑表現出至少 75% 的 siRNA 轉染效率。通過 qRT-PCR 確定轉染效率。

圖 4. Lamin A/C 在 DU145 細胞中的蛋白質表達。按照 Altogen Biosesystems 轉染方案，將表達 Lamin A/C 或靶向 Lamin A/C 的 siRNA 的 DNA 質粒轉染到 DU145 細胞中。在轉染後 72 小時，通過蛋白質印跡分析細胞的蛋白質表達水平（通過總蛋白質標準化，每孔加載 10 µg 總蛋白質）。未處理的細胞用作陰性對照。

MCF-7細胞轉染試劑（乳腺癌細胞，HTB-22）

圖 5 。在用靶向 GAPD 或非沉默 siRNA 的 siRNA 轉染的 MCF-7 細胞中，使用實時 RT-PCR 對 GAPD mRNA 水平進行量化。轉染後 48 小時，收獲細胞並通過實時 RT-PCR 分析 GAPDH mRNA 表達水平。數據針對 18S rRNA 信號進行標準化。對照樣品是模擬轉染的或未處理的。將值歸一化為(wei) 未處理的樣品。數據為(wei) 平均值±SD (n=3)。

• 專(zhuan) 有陽離子脂質配方

• 小RNA（siRNA、shRNA、miRNA）、mRNA、pDNA的高轉染效率

• 產(chan) 生一致的結果，批次到批次、板到板和孔到孔

• 在血清存在下工作

• 一種經過驗證的用於(yu) 建立穩定細胞係的試劑

• 試劑表現出至少 85% 的 siRNA 轉染效率。通過 qRT-PCR 確定轉染效率。

圖 6. MCF-7 細胞中 GAPDH 的蛋白表達。按照 Altogen Biosesystems 轉染方案，將表達 GAPDH 或靶向 GAPDH 的 siRNA 的 DNA 質粒轉染到 MCF-7 細胞中。在轉染後 72 小時，通過蛋白質印跡分析細胞的蛋白質表達水平（通過總蛋白質標準化，每孔加載 10 µg 總蛋白質）。未處理的細胞用作陰性對照。

HepG2細胞轉染試劑（肝癌細胞，HB-8065）

圖 7.在轉染了靶向 GAPD 或非沉默 siRNA 的 siRNA 的 HepG2 細胞中，使用實時 RT-PCR 對 GAPD mRNA 水平進行了定量。轉染後 48 小時，收獲細胞並通過實時 RT-PCR 分析 GAPDH mRNA 表達水平。數據針對 18S rRNA 信號進行標準化。對照樣品是模擬轉染的或未處理的。將值歸一化為(wei) 未處理的樣品。數據為(wei) 平均值±SD (n=3)。

• 小RNA（siRNA、shRNA、miRNA）、mRNA、pDNA的高轉染效率

• 有效且穩健的細胞內(nei) 遞送

• 產(chan) 生一致的結果，批次到批次、板到板和孔到孔

• 在血清存在下工作

• 一種經過驗證的用於(yu) 建立穩定細胞係的試劑

• 試劑表現出至少 90% 的 siRNA 轉染效率。通過 qRT-PCR 確定轉染效率。

圖 8. HepG2 細胞中 GAPDH 的蛋白表達。按照 Altogen Biosesystems 轉染方案，將表達 GAPDH 或靶向 GAPDH 的 siRNA 的 DNA 質粒轉染到 HepG2 細胞中。在轉染後 72 小時，通過蛋白質印跡分析細胞的蛋白質表達水平（通過總蛋白質標準化，每孔加載 10 µg 總蛋白質）。未處理的細胞用作陰性對照。

結論：

轉染是一項經過充分測試且至關(guan) 重要的生物技術，它使研究人員能夠直接在細胞中研究基因產(chan) 物和基因功能。不同的轉染方法允許以非常特定的方式傳(chuan) 遞遺傳(chuan) 物質，從(cong) 而使其成為(wei) 臨(lin) 床前生物學研究中極其通用的工具。選擇最佳方法涉及實施最佳轉染試劑，以及選擇最佳實驗設計。

Altogen Biosesystems 提供預優(you) 化和細胞係特異性體(ti) 外轉染試劑和試劑盒。在他們(men) 的網站上了解更多關(guan) 於(yu) 這些轉染試劑和試劑盒的信息，並加快您今天的臨(lin) 床前生物學研究。