ELISA的實驗原理和操作步驟

一、實驗原理

ELISA是以免疫學反應為(wei) 基礎，將抗原、抗體(ti) 的特異性反應與(yu) 酶對底物的高效催化作用相結合起來的一種敏感性很高的試驗技術。由於(yu) 抗原、抗體(ti) 的反應在一種固相載體(ti) —聚苯乙烯微量滴定板的孔中進行，每加入一種試劑孵育後，可通過洗滌除去多餘(yu) 的遊離反應物，從(cong) 而保證試驗結果的特異性與(yu) 穩定性。在實際應用中，通過不同的設計，具體(ti) 的方法步驟可有多種。即:用於(yu) 檢測抗體(ti) 的間接法、用於(yu) 檢測抗原的雙抗體(ti) 夾心法以及用於(yu) 檢測小分子抗原或半抗原的抗原競爭(zheng) 法等等。比較常用的是ELISA雙抗體(ti) 夾心法及ELISA間接法。

二、實驗材料

1、試劑

(1)包被緩衝(chong) 液(PH9.6 0.05M碳酸鹽緩衝(chong) 液):

NaCO3：1.59克、NaHCO3：2.93克，加蒸餾水至1000ml

(2)洗滌緩衝(chong) 液(PH7.4 PBS)：0.15M　KH2PO4 0.2克　Na2HPO4·12H2O　2.9克　NaCl  8.0克KCl 0.2克 Tween-20 0.05％ 0.5ml 加蒸餾水至1000ml

(3)稀釋液:牛血清白蛋白(BSA) 0.1克　加洗滌緩衝(chong) 液至100ml　或以羊血清、兔血清等 血清與(yu) 洗滌液配成5～10%使用。

(4)終止液(2M H2SO4）：蒸餾水178.3ml，逐滴加入濃硫酸(98%)21.7ml。

(5)底物緩衝(chong) 液(PH5.0磷酸棗檸檬酸)：0.2M Na2HPO4(28.4克/L) 25.7ml　0.1M 檸檬酸(19.2克/L) 24.3ml　加蒸餾水50ml。

(6)TMB(四甲基聯苯胺)使用液：TMB(10mg/5ml無水乙醇) 0.5ml底物緩衝(chong) 液(PH5.5) 10ml 0.75% H2O232μl

(7)ABTS使用液：ABTS　0.5mg　底物緩衝(chong) 液(PH5.5) 1ml　3% H2O2　2μl

(8)抗原、抗體(ti) 和酶標記抗體(ti) 。

(9)正常人血清和陽性對照血清。

2、器材:

(1)聚苯乙烯塑料板(簡稱酶標板)40孔或96孔，ELISA檢測儀(yi) ，50μl及100μl加樣器，塑料滴頭，小毛巾，洗滌瓶。

(2)小燒杯、玻璃棒、試管、吸管和量筒等。

(3)4℃冰箱，37℃孵育箱。

三、實驗步驟

（一）用於(yu) 檢測未知抗原的雙抗體(ti) 夾心法:

1、包被：用0.05M PH9.牰碳酸鹽包被緩衝(chong) 液將抗體(ti) 稀釋至蛋白質含量為(wei) 1～10μg/ml。在每個(ge) 聚苯乙烯板的反應孔中加0.1ml，4℃過夜。次日，棄去孔內(nei) 溶液，用洗滌緩衝(chong) 液洗3次，每次3分鍾。(簡稱洗滌，下同)。

2、加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.1ml於(yu) 上述已包被之反應孔中，置37℃孵育1小時。然後洗滌。(同時做空白孔，陰性對照孔及陽性對照孔)。

3、加酶標抗體(ti) ：於(yu) 各反應孔中，加入新鮮稀釋的酶標抗體(ti) (經滴定後的稀釋度)0.1ml。37℃孵育0.5～1小時，洗滌。

4、加底物液顯色：於(yu) 各反應孔中加入臨(lin) 時配製的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分鍾。

5、終止反應：於(yu) 各反應孔中加入2M硫酸0.05ml。

6、結果判定：可於(yu) 白色背景上，直接用肉眼觀察結果：反應孔內(nei) 顏色越深，陽性程度越強，陰性反應為(wei) 無色或極淺，依據所呈顏色的深淺，以“+"、“-"號表示。也可測O·D值：在ELISA檢測儀(yi) 上，於(yu) 450nm(若以ABTS顯色，則410nm)處，以空白對照孔調零後測各孔O·D值，若大於(yu) 規定的陰性對照OD值的2.1倍，即為(wei) 陽性。

（二）用於(yu) 檢測未知抗體(ti) 的間接法：

用包被緩衝(chong) 液將已知抗原稀釋至1～10μg/ml，每孔加0.1ml，4℃過夜。次日洗滌3次。加一定稀釋的待檢樣品(未知抗體(ti) )0.1ml於(yu) 上述已包被之反應孔中，置37℃孵育1小時，洗滌。(同時做空白、陰性及陽性孔對照)於(yu) 反應孔中，加入新鮮稀釋的酶標第二抗體(ti) (抗抗體(ti) )0.1ml，37℃孵育30-60分鍾，洗滌，後一遍用DDW洗滌。其餘(yu) 步驟同“雙抗體(ti) 夾心法"的4、5、6。

四、注意事項

1.正式試驗時，應分別以陽性對照與(yu) 陰性對照控製試驗條件，待檢樣品應作一式二份，以保證實驗結果的準確性。有時本底較高，說明有非特異性反應，可采用羊血清、兔血清或BSA等封閉。

2.在ELISA中，進行各項實驗條件的選擇是很重要的，其中包括:

(1)固相載體(ti) 的選擇：許多物質可作為(wei) 固相載體(ti) ，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纖維素等。其形式可以是凹孔平板、試管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何種載體(ti) ，在使用前均可進行篩選：用等量抗原包被，在同一實驗條件下進行反應，觀察其顯色反應是否均一性，據此判明其吸附性能是否良好。

(2)包被抗體(ti) (或抗原)的選擇：將抗體(ti) (或抗原)吸附在固相載體(ti) 表麵時，要求純度要好,吸附時一般要求PH在9.0～9.6之間。吸附溫度，時間及其蛋白量也有一定影響,一般多采用4℃18～24小時。蛋白質包被的適濃度需進行滴定：即用不同的蛋白質濃度(0.1、1.0和10μg／ml等)進行包被後，在其它試驗條件相同時，觀察陽性標本的OD值。選擇OD值大而蛋白量少的濃度。對於(yu) 多數蛋白質來說通常為(wei) 1～10μg／ml。

(3)酶標記抗體(ti) 工作濃度的選擇：首先用直接ELISA法進行初步效價(jia) 的滴定(見酶標記抗體(ti) 部份)。然後再固定其它條件或采取“方陣法"(包被物、待檢樣品的參考品及酶標記抗體(ti) 分別為(wei) 不同的稀釋度)在正式實驗係統裏準確地滴定其工作濃度。

(4)酶的底物及供氫體(ti) 的選擇：對供氫體(ti) 的選擇要求是價(jia) 廉、安全、有明顯地顯色反應，而本身無色。有些供氫體(ti) (如OPD等)有潛在的致癌作用，應注意防護。有條件者應使用不致癌、靈敏度高的供氫體(ti) ，如TMB和ABTS是目前較為(wei) 滿意的供氫體(ti) 。底物作用一段時間後，應加入強酸或強堿以終止反應。通常底物作用時間，以10-30分鍾為(wei) 宜。底物使用液必須新鮮配製，尤其是H2O2在臨(lin) 用前加入。