Lumafluor Green RetroBeads

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原始、可靠的熒光示蹤劑

luma fluor/Green retro beads IX(100 l)luma fluor是Lumafuor公司的第一個(ge) 反向示蹤產(chan) 品，也是一個(ge) 被證明有效的產(chan) 品(該產(chan) 品的有效性已被數百篇從(cong) 無脊椎動物到哺乳動物實驗的研究論文所證實)。

該示蹤劑產(chan) 品在體(ti) 內(nei) 注射時濃度高，不易擴散，信號強，對活細胞或活體(ti) 無毒，存活時間在一年以上。它與(yu) 以下大多數示蹤劑、原位雜交檢測技術和免疫組織化學技術兼容。

Further details are presented in: Katz, L.C., Burkhalter, A., and Dreyer, W.D. Fluorescent latex microspheres as a retrograde neuronal marker for in vivo and in vitro studies of visual cortex. Nature 310: 498-500 (1984), and Katz, L.C. and Iarovici, D.M. Green fluorescent latex microspheres: a new retrograde tracer. Neuroscience 34: 511-520 (1990).

熒光乳膠微球的使用方案 

如何供應:封閉的小瓶含有懸浮在蒸餾水中的珠子的濃縮溶液。如果紅色珠子用於(yu) 神經元路徑的逆行追蹤，溶液可以原樣使用，或者稀釋。在大鼠視覺皮層中，當使用紅色珠子時，1:4的稀釋度似乎不會(hui) 降低逆行標記的質量或程度。然而，對於(yu) 初始實驗，我們(men) 強烈建議使用全強度的溶液。除蒸餾水外，標準鹽溶液(NaCl，KCl)也可用作稀釋劑。所提供的綠珠*全為(wei) 逆行追蹤實驗做好了準備。不建議稀釋綠珠。

存儲(chu) :珠溶液應儲(chu) 存在冰箱中的加濕容器中，以防止蒸發。不要凍結！被冰凍的珠子將不起作用，並且不能被解救。如果珠子變幹，它們(men) 就不能被重組。這種材料沒有規定保存期限，但是，如果儲(chu) 存得當，可以保存幾年。

應用:最好使用壓力注射珠子(例如，1 ml Hamilton注射器，或加壓空氣注射係統)。對於(yu) 局部回路工作，已經通過具有30-50 μm直徑吸頭的玻璃移液管注入了非常小的體(ti) 積(30-50 nl)。對於(yu) 常規逆行追蹤，使用更大體(ti) 積(0.1-0.3 ul)和更大直徑的移液器吸頭。然而，即使注射量很大，珠子也不會(hui) 從(cong) 注射部位擴散很遠(通常小於(yu) 1 mm)。因此，為(wei) 了標記投射到大結構的所有或大部分神經元，應該進行幾次注射。不推薦將珠的離子電滲應用作為(wei) 遞送示蹤劑的有效手段。然而，珠子確實有一個(ge) 淨負電荷。

生存時間:在大多數溫血脊椎動物係統中，注射後的最短有效存活時間約為(wei) 24小時。標記強度隨著存活時間的延長而增加，最長可達48小時。48小時後，沒有觀察到標記強度的增加(或減少)。這些值在冷血動物中可能有相當大的不同，建議初始存活時間為(wei) 一周。最大存活時間尚未確定，但即使在14個(ge) 月的存活時間後，標簽在質量或程度上也沒有變化。細胞可能會(hui) 被*久標記。未觀察到對動物或神經元的毒性作用。

定影和處理:標準固定是用0.1 M磷酸鹽緩衝(chong) 液洗滌，然後用0.1 M磷酸鹽緩衝(chong) 液(pH 7.4)中的4%多聚甲醛洗滌。戊二醛會(hui) 產(chan) 生大量的組織自體(ti) 熒光，這可能會(hui) 模糊珠標記的神經元，如果可能，應避免使用。綠珠在戊二醛固定材料中全看不見。冷凍切片收集在磷酸鹽緩衝(chong) 液中，固定在明膠包被的載玻片上，風幹。*全幹燥後，載玻片可在二甲苯中清洗1分鍾，蓋上塗有Fluoromount或Krystalon的蓋子。Fluoromount可從(cong) Atomergic Chemetals Corp .，Farmingdale，NY獲得；Krystalon來自新澤西州吉布森鎮的Harleco (EM Industries)。

短暫接觸酒精和二甲苯不會(hui) 造成傷(shang) 害，但長時間接觸(超過5分鍾)會(hui) 破壞珠子。珠子對甘油非常敏感，如果放在含甘油的溶液中會(hui) 迅速褪色。在需要非*久性清潔/固定劑的情況下，水楊酸甲酯優(you) 於(yu) 甘油。如果載玻片保存在暗處，細胞中的標記至少在一年內(nei) 不會(hui) 褪色(盡管背景自發熒光可能會(hui) 顯著增加)。迄今為(wei) 止，在塑料包埋後保留珠標記的嚐試尚未成功。

觀察:紅色珠子中的染料是羅丹明，因此可以使用任何為(wei) 羅丹明設置的熒光濾光片。一些較舊的尼康羅丹明濾鏡組給出了非常高的背景，這可以使標記的細胞不可見。Zeiss和Leitz標準羅丹明濾光片均獲得了良好的效果。對於(yu) 綠珠，寬帶熒光素濾光器效果很好。黃色濾鏡組給出了更強烈的信號，但代價(jia) 是更高的背景。窄帶熒光素濾光器將給出比寬帶濾光器弱得多的信號。

即使經過長時間的觀察或顯微攝影，珠子也不會(hui) 明顯褪色。

對於(yu) 低倍率、低數值孔徑的幹燥物鏡(如X4、X10)，標簽通常不可見。如果細胞被強烈標記，X10浸沒物鏡(數值孔徑為(wei) 0.4或更大)或更高功率的幹物鏡通常會(hui) 顯示細胞。然而，X25浸沒物鏡通常會(hui) 非常清晰地顯示出低倍率物鏡所遺漏的標記細胞。這些警告對於(yu) 綠珠來說尤其如此。在決(jue) 定實驗無效之前，用浸沒物鏡檢查注射部位附近的切片。應該存在大量局部標記的細胞。

綠珠用戶的附加信息:在迄今為(wei) 止所做的工作中，年輕的動物似乎比年老的動物更好地傳(chuan) 遞標簽。此外，年輕動物的組織自體(ti) 熒光較低。因此，在涉及綠珠的實驗中，如果可能的話，最好使用較年輕的動物。

因為(wei) 綠珠在比紅珠更短的波長下被激發，組織自體(ti) 熒光是一個(ge) 更大的問題。因此，將自發熒光最小化的努力將產(chan) 生更好的對比信號。減少自體(ti) 熒光的方法包括:1)使用更薄的切片(例如30 um而不是40或50 μm)；2)使用更年輕的動物，以及3)在蓋玻片後立即檢查切片(背景隨著時間推移而增加)。

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