Cre Recombinase, TAT-Cre (Tat-NLS-Cre, HTNC, HTNCr

Cre Recombinase, TAT-Cre (Tat-NLS-Cre, HTNC, HTNCre)

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Cre重組酶通常縮寫(xie) 為(wei) Cre，是一種I型酶拓撲異構酶來自P1噬菌體(ti) 催化loxP位點間DNA的位點特異性重組。這種酶不需要任何能量輔因子Cre介導的重組底物和反應產(chan) 物之間迅速達到平衡。loxP識別元件是一個(ge) 34堿基對(bp)序列，由兩(liang) 個(ge) 13 bp反向重複序列組成，側(ce) 翼是一個(ge) 8 bp間隔區，提供方向性。重組產(chan) 物依賴於(yu) loxP位點的位置和相對方向。含有單個(ge) loxP序列的兩(liang) 種DNA將會(hui) 融合，而相同方向的loxP序列之間的DNA將以環狀形式被切除，相對的loxP序列之間的DNA相對於(yu) 其餘(yu) 的DNA是反向的。

Cre重組酶被用作修飾基因和染色體(ti) 的工具。在這種方法中，Cre重組酶用於(yu) 在實驗動物中刪除LoxP位點側(ce) 翼的DNA片段(也稱為(wei) “floxed")。在許多轉基因物種中，它已被用於(yu) 產(chan) 生具有僅(jin) 限於(yu) 某些細胞類型的突變(組織特異性敲除)的動物或具有可通過給藥激活的突變(誘導性敲除)的動物。具有組織特異性或可誘導的Cre表達的轉基因品係的可獲得性允許研究人員簡單地通過將固定的動物繁殖到預先存在的Cre轉基因動物來滅活或激活感興(xing) 趣的基因。誘導型Cre重組酶係統的一個(ge) 例子是Cre-ER (ER =雌激素受體(ti) 蛋白)係統，其中腹腔內(nei) 注射關(guan) 於(yu) 三苯氧胺會(hui) 引起取決(jue) 於(yu) 劑量的切除固定位點(即使選擇的基因失活)。

重組Cre重組酶(TAT-Cre)從(cong) 攜帶工程質粒的大腸杆菌菌株中純化，所述工程質粒編碼來自噬菌體(ti) P1的增強形式的Cre重組酶。這種Cre重組酶具有一個(ge) N-末端6XHis標簽、一個(ge) Tat肽(GRKKRRQRRRPPAGTSVSL)和一個(ge) NLS序列(PKKKRKV)。與(yu) 其它形式的Cre重組酶(例如HNC、TCH6、HC、HNCM、CH)相比，HTNC是轉導(體(ti) 內(nei) )和隨後重組中*有效的蛋白質。成纖維細胞報告細胞與(yu) 1微米HTNC孵育1至2小時，可導致60 ~ 90%的細胞轉化。向培養(yang) 基中添加100微米氯喹可以進一步增強轉導和重組。

應用程序

• 用於亞克隆或載體/克隆工程的體外LoxP重組

• 體外轉導到包括幹細胞的培養細胞中

性能：

濃度:2、5或10毫克/毫升。

分子量:43千道爾頓

QC: Tat-Cre在HEK293T- Cre報告細胞中誘導80~100%的重組效率。用報道質粒DNA: LoxP-RFP-Stop-LoxP-GFP轉染HEK 293t-細胞，然後加入1個(ge) 微米純化的Tat-Cre蛋白。

圖1: 0:添加Tat-Cre前；用Tat-Cre轉導後1至5天。

內(nei) 毒素水平:< 0.1歐盟單位/微克

通過SDS-PAGE和HPLC分析，純度> 98%。

單位定義(yi) ：100單位的標準被定義(yi) 為(wei) 在HEK 293T報道細胞係分析中誘導50% GFP表達所需的1.0 mL組織培養(yang) 基中TAT-CRE的量(μg)。

穩定性：零下80度2年oC.零下20度6個(ge) 月oC.最長3周，4oC

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