Luna® 通用探針一步法 RT-qPCR 試劑盒

NEB Luna 通用探針一步法 RT-qPCR 試劑盒經過優(you) 化，適用於(yu) 水解探針法的目標 RNA 序列實時定量。一步法 RT-qPCR 為(wei) RNA 檢測和定量提供了一種便捷、強大的方法。在同一管中，RNA 首先由反轉錄酶轉化為(wei) cDNA，然後使用 DNA 依賴型 DNA 聚合酶擴增 cDNA，從(cong) 而可以進行 qPCR 定量。探針法 qPCR/RT-qPCR 原理是利用聚合酶的 5´→3´ 核酸外切酶活性，將淬滅的目標特異性探針切斷發出熒光，並實時監測熒光值的增加，以測量每個(ge) 循環中的 DNA 擴增。在熒光信號顯著超過背景熒光的位置，可以確定循環數或 Cq 值。Cq 值可用於(yu) 評估兩(liang) 個(ge) 或多個(ge) 樣品的靶基因相對豐(feng) 度，通過已知稀釋濃度樣品的標準曲線，可對靶基因進行絕對定量。

在 Luna 通用一步法探針 RT-qPCR 試劑盒中，聯合使用熱啟動 Taq DNA 聚合酶與(yu) 新型 WarmStart 反轉錄酶，通過適配體(ti) 可逆抑製來雙重控製酶活性。這種溫控活化機製可避免熱循環前的非特異擴增，從(cong) 而讓室溫建立體(ti) 係更安全。經改造的 Luna WarmStart 反轉錄酶的熱穩定性比許多反轉錄酶更高，其最佳反應溫度為(wei) 55℃。對於(yu) 困難靶標/模板，最多可將反轉錄步驟的溫度升至 60℃，不會(hui) 影響 Luna 性能。

注意：為(wei) 確保 Luna WarmStart 反轉錄酶全激活，建議溫育溫度不低於(yu) 50℃。

Luna 通用探針一步法反應混合液濃度為(wei) 2X，包含熱啟動 Taq DNA 聚合酶、dNTP 和所有必需的緩衝(chong) 液成分。該預混液包含惰性參比染料，可與(yu) 多種 qPCR 儀(yi) 器兼容，包括需要高 ROX 或低 ROX 參比信號的儀(yi) 器。特色的是：預混液還包含可防止交叉汙染的 dUTP，以及有助於(yu) 觀察反應體(ti) 係建立的非熒光可見示蹤染料。該示蹤染料與(yu) qPCR 常用熒光團的光譜沒有重疊，因此不會(hui) 幹擾實時檢測。

Luna WarmStart 反轉錄酶預混液的濃度為(wei) 20X，其中包含 Luna WarmStart 反轉錄酶以及用於(yu) 防止 RNA 降解的小鼠 RNase 抑製劑（詳情請見產(chan) 品手冊(ce) 中的模板製備）。適用於(yu) 各種 RNA 樣品類型（總 RNA、poly（A）-RNA 等）和來源。

.圖 1：NEB 的 Luna 通用探針一步法 RT-qPCR 試劑盒具有更高的靈敏度、更出眾(zhong) 的可重複性以及更優(you) 異的 RT-qPCR 表現

使用 Luna 通用探針一步法 RT-qPCR 試劑盒，執行了人 GAPDH 基因的 RT-qPCR 靶標檢測，起始量模板為(wei) 8 個(ge) 10 倍梯度稀釋的 Jurkat 總 RNA（1 μg – 0.1 pg），每個(ge) 濃度的樣品做 8 個(ge) 重複。實驗按照試劑盒建議的操作流程進行，反應中包含一個(ge) 55℃ 溫育 10 分鍾的反轉錄步驟，以便於(yu) 具有熱穩定性的 Luna WarmStart 反轉錄酶發揮作用。

圖 2：NEB 的 Luna 通用探針一步法 RT-qPCR 試劑盒在多重檢測中展現強大功效

使用 Luna 通用探針一步法 RT-qPCR 試劑盒，執行了人 GAPDH 基因、核糖體(ti) 蛋白 L32g 和 PI3 激酶相關(guan) 的激酶 SMG1 基因的多重 RT-qPCR 靶標檢測。起始量模板濃度為(wei) 7 個(ge) 10 倍稀釋的 Jurkat 總 RNA（1 μg – 1 pg），每個(ge) 濃度的樣品做 4 個(ge) 重複。擴增圖表如上所示，左邊是疊加的結果，右邊是每個(ge) 基因單獨的檢測結果。若要解釋拷貝數的差異，低拷貝的模板（SMG1）使用的引物濃度為(wei) 0.4 µM，高拷貝的模板（L32g 和 GAPDH）使用的引物濃度為(wei) 0.2 µM。Luna 產(chan) 品在多重 RT-qPCR 檢測中展現出高效率、可重複性、靈敏度和性能。

圖 3：通過與(yu) 市售的探針法 RT-qPCR 試劑相比，Luna 產(chan) 品展現出更好的穩定性和特異性

使用市售的 RT-qPCR 試劑對 7 個(ge) 不同豐(feng) 度、長度和 GC 含量的 RT-qPCR 靶標進行測試。測試均根據產(chan) 品說明書(shu) 進行，數據來源於(yu) 兩(liang) 位實驗人員。從(cong) 以下方麵評估了反應結果：擴增效率、低起始量檢測能力及無模板擴增值（ΔCq = 無模板對照的平均 Cq – *低起始量的平均 Cq）。此外，還評估了擴增結果的一致性、可重複性和總體(ti) 曲線質量（質量分數）。柱狀圖展示了達到可接受的性能標準的目標百分比（由點圖上的綠色框表示，質量分數 > 3）。NEB 和其它供應商的結果如下所示：Quanta，qScript™ XLT 1-Step RT-qPCR ToughMix®；ABI，TaqMan® RNA-to-Ct 1-Step Kit；QIAGEN，QuantiFast® Probe RT-PCR Kit；Bio-Rad，iTaq™ Universal Probes One-Step Kit；Promega®，GoTaq® Probe 1-Step RT-qPCR System。NEB 的 Luna 通用探針一步法 RT-qPCR 試劑盒性能優(you) 於(yu) 其它測試試劑。

• 注意事項

1. 引物設計
   使用 qPCR 引物設計軟件（如 Primer3），可在盡力減少非特異性擴增和引物二聚體(ti) 的情況下提高擴增成功率。GC/AT 含量平衡（40 – 60%）的靶標，往往具有最高的擴增效率。若可行，盡量多輸入目標周圍區域序列，以便引物序列設計更加完善，同時使用檢索功能，檢索相關(guan) 序列數據庫（避免潛在的非特異性擴增）。建議在已知的 RNA 剪接位點範圍內(nei) 設計引物，防止基因組 DNA 擴增。

2. 引物和探針濃度
   對大多數靶標而言，400 nM（每個(ge) 引物）的終濃度就可以提供最佳性能。如有必要，可以在 100 – 900 nM 範圍內(nei) 優(you) 化引物濃度。為(wei) 獲得最佳結果，探針應包括在 200 nM 的範圍內(nei) 。可以在 100 – 500 nM 範圍內(nei) 優(you) 化探針濃度。

3. 多重檢測
   在確定要納入多重檢測反應中的熒光團時，一定要選擇兼容的熒光發光基團和熒光吸收基團（例如，所選實時儀(yi) 器可以容納且熒光光譜重疊度最小）。若為(wei) 依賴 ROX 的儀(yi) 器，避免使用 ROX 標記的探針。包含 400 nM 的正向和反向引物，以及反應中要檢測的各靶標的 200 nM 探針。對於(yu) 豐(feng) 度差異較大的靶標，推薦對豐(feng) 度較高的靶標使用較低的引物濃度（如 200 nM）。如有必要，根據性能調整濃度（引物 100 – 900 nM，探針 100 – 500 nM）。將 qPCR 方案加載到實時儀(yi) 器上時，一定要選擇適當的光學通道，因為(wei) 有些儀(yi) 器的單通道記錄模式會(hui) 妨礙多重檢測數據的收集和分析。在嚐試進行多重檢測之前，應單獨測試引物和探針組的功能。

4. 擴增子長度
   為(wei) 確保成功獲得一致的 qPCR 結果，最大限度地提高 PCR 效率非常重要。其中一個(ge) 重要方麵就是設計短片段 PCR 擴增子（通常為(wei) 70 – 200 bp）。如果靶標超出範圍，可能需要對實驗進行優(you) 化。

5. 模板製備及相關(guan) 濃度
   Luna RT-qPCR 與(yu) 通過傳(chuan) 統核酸純化方法製備的 RNA 樣品兼容。為(wei) 保障長效穩定性，製備好的 RNA 應儲(chu) 存在含有 EDTA 的緩衝(chong) 液中（如 1X TE）；稀釋液應在 qPCR 實驗前采用 TE 或水新鮮製備。注意：RNA 模板質量會(hui) 對 RT-qPCR 效率產(chan) 生極大的影響。處理 RNA 時應采取適當的預防措施，防止 RNase 或 DNase 汙染。強烈推薦使用（提供的）無核酶水。若可行，可使用 DNase I 處理 RNA，將殘留基因組 DNA 除去。
   一般來說，標準品和未知樣品的有效濃度範圍應該在 108 拷貝到 10 拷貝之間。注意：根據泊鬆分布，對於(yu) 單拷貝範圍內(nei) 的稀釋液，某些樣品會(hui) 包含多個(ge) 拷貝，某些則不含拷貝。對於(yu) 總 RNA，Luna 一步法試劑盒可以在 8 個(ge) 濃度梯度的起始量範圍內(nei) （1 μg – 0.1 pg）提供良好的線性定量能力。對於(yu) 大多數靶標，推薦使用 100 ng – 10 pg 的總 RNA 標準起始量範圍。對於(yu) 經純化的 mRNA，推薦起始量 ≤ 100 ng。對於(yu) 體(ti) 外轉錄的 RNA，推薦起始量 ≤ 109 拷貝。

6. ROX 參比染料

   對於(yu) 某些實時儀(yi) 器，建議使用惰性參比染料（通常是 ROX）來避免儀(yi) 器限製（例如“邊緣效應"、氣泡、微小體(ti) 積差異以及反應過程中塵埃或微粒的自發熒光）造成的孔與(yu) 孔之間的反應誤差。不過，對於(yu) 模板/引物的加樣錯誤、異質混合液和蒸發/凝結問題造成的誤差，ROX 校正幾乎不起作用。

   以下 Luna® qPCR 產(chan) 品包含通用惰性參比染料：Luna 通用 qPCR 預混液（NEB #M3003）、Luna 通用探針法 qPCR 預混液（NEB #M3004）、Luna 通用一步法 RT-qPCR 試劑盒（NEB #E3005）和 Luna 通用探針一步法 RT-qPCR 試劑盒（NEB #E3006）。這些產(chan) 品兼容多種儀(yi) 器（高 ROX、低 ROX、無 ROX），因此無需額外的 ROX 來進行校正。

   Luna 探針一步法 RT-qPCR 試劑盒（無 ROX）（E3007）不含參比染料，與(yu) 無需使用 ROX 的儀(yi) 器兼容。如果需要 ROX 校正，可自行添加 ROX。如需詳細信息，請參閱儀(yi) 器廠商說明書(shu) 。

7. 防止交叉汙染
   RT-qPCR 是一種非常靈敏的方法，在新的 RT-qPCR 測定中，之前擴增反應的產(chan) 物汙染會(hui) 導致各種問題，例如假陽性結果和靈敏度降低。防止這種“交叉"汙染的最好辦法就是嚴(yan) 格按照實驗程序操作，避免擴增後打開反應容器。不過，為(wei) 進一步滿足預防汙染的要求，Luna qPCR 混合液中包含了 dUTP/dTTP 混合物，從(cong) 而可在擴增過程中將 dU 結合到 DNA 產(chan) 物中。用尿嘧啶-DNA 糖基化酶（UDG）對 qPCR/RT-qPCR 實驗進行預處理，通過切除尿嘧啶堿基來消除之前擴增的含尿嘧啶的產(chan) 物，從(cong) 而產(chan) 生不可擴增的 DNA 產(chan) 物。使用熱敏 UDG 至關(guan) 重要，因為(wei) 需要將 UDG 全滅活，防止其破壞新合成的 qPCR 產(chan) 物。
   
   為(wei) 防止交叉汙染，應在反應混合液中添加終濃度為(wei) 0.025 U/μl 的南極熱敏 UDG（NEB #M0372）。要最大限度地消除汙染產(chan) 物，可在室溫下進行 qPCR 實驗，或在進行初始變性之前在 25℃ 條件下溫育 10 分鍾。

8. 反應體(ti) 係建立與(yu) 循環條件
   Luna 一步法試劑盒具有雙重熱啟動功能，因此無需在冰上建立反應體(ti) 係或在使用前預熱熱循環儀(yi) 。
   如果采用 96 孔板，推薦使用 20 μl 最終反應體(ti) 積。
   如果采用 384 孔板，推薦使用 10 μl 最終反應體(ti) 積。
   對儀(yi) 器循環條件進行編程時，確保在延伸結束時讀取模板讀數，並在循環完成後繪製變性（融化）曲線，以分析產(chan) 物特異性。
   大部分應用隻需 40 個(ge) 循環的擴增，但低起始量樣品可能需要 45 個(ge) 循環。

paybet雷竞技是一家集成服務商，公司堅持“一站式"服務模式，為(wei) 客戶全麵解決(jue) 實驗、生產(chan) 、開發需求。公司整合國際與(yu) 國內(nei) 資源，加強網絡建設，提高公司內(nei) 部運作效率，為(wei) 客戶提供方便、快捷的服務。

實驗試劑的注意事項:

(1)切忌與(yu) 皮膚直接接觸。

(2)要用潔淨的專(zhuan) 用取用試劑，用同一種工具不允許同時連續取用多種試劑。應取完一種試劑後，將工具洗淨(藥勺要擦幹)後，才可取用另一種試劑。

(3)易燃易爆性rabet雷竞技必須存放於(yu) 專(zhuan) 用的危險性試劑倉(cang) 庫裏，並存放在不燃燒材料製作的櫃、架上，溫度不宜超過28℃，使用時要穿好必要的防護用具實驗室少量瓶裝可設危險品專(zhuan) 櫃，按性質分格貯存，同一格內(nei) 不得混放氧化劑等性質的抵觸品，並根據貯存種類配備相應的滅火設備和自動報警裝置。低沸點極易燃燒試劑宜低溫下貯存(5℃以下，禁用有電火花產(chan) 生的普通家用電冰箱貯存。

(4)強腐蝕類 存放處要求陰涼通風，並與(yu) 其他藥品隔離放罟。

(5)強氧化劑試劑是過氧化物或含氧酸及其鹽,在適當條件下會(hui) 發生爆炸,並可與(yu) 有機物、鎂、鋁、鋅粉、硫等易燃固體(ti) 形成爆炸混合物。(存放處要求陰涼通風，溫度不得超過30℃℃。

(6)放射性類 一般化驗室不可能有放射性物質。化驗操作這類物質需要特殊防護設備和知識以保護人身安全，並防止放射性物質的汙染與(yu) 擴散

Luna® 通用探針一步法 RT-qPCR 試劑盒