Fluoro-Gold

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美國 Fluorochorome 公司於(yu) 1985 年成立於(yu) 美國科羅拉多州丹佛市，Fluorochorome 一直 致力於(yu) 熒光染料的研究與(yu) 開發，其產(chan) 品Fluoro Gold（熒光金）自 1985 年來在全球範圍 內(nei) 被廣泛應用，並有大量的參考文獻。同時，Fluorochrome公司特別開發了高靈敏度的 Fluoro-Gold Antibody 、以及 Fluoro-Ruby（紅色熒光金）等產(chan) 品，Fluorochrome 公司堅 持以優(you) 質的產(chan) 品和熱情的服務贏得了良好的口碑。

小鼠右頸髓 DAPI染色縱切麵的顯微照片，展示了典型的熒光金標記運動神經元柱。圖片最初發表於(yu) Tosolini AP、Mohan R、MorrisR(2018)。以小鼠前肢運動終板區域的全長為(wei) 目標可增加熒光金進入相應脊髓運動神經元的吸收。Front.Neurol. 4:58, 1-10,4

大鼠前肢中強陽性熒光金標記的運動神經元。圖片最初發表於(yu) TosoliniAP,Mohan R(2012)。大鼠前肢運動神經元柱的空間特征。神經科學200:19-30,22.

成年小鼠腰椎脊髓的顯微照片，顯示了用 DAPI複染的熒光金標記的典型柱狀圖。圖片最初發表於(yu) MohanR, Tosolini AP, Morris, R.(2014)。神經科學 274:318-330,323

1.背景

熒光金的使用方法與(yu) 其他熒光示蹤劑基本相同，但在注射後存活時間、濃度範圍、組織處理以及與(yu) 其他組織化學技術的兼容性方麵，熒光金更為(wei) 靈活。

2.儲(chu) 存和保質期

幹熒光金應存放在4 攝氏度的避光密閉容器中。妥善儲(chu) 存後，熒光金的保質期應超過一年。溶液中的染料也應存放在4 攝氏度的避光密閉容器中，並應保持穩定至少六個(ge) 月。

8.載體(ti)

Fluoro-Gold 可溶於(yu) 蒸餾水或 0.9%鹽水。Fluoro-Gold 在堿性 pH 下不溶解。但它也可以用作0.2M 中性磷酸鹽緩衝(chong) 液中的懸浮液。

4.染料濃度

氟金已成功應用於(yu) 濃度範圍為(wei) 1-10%的染料。最初建議使用 4%的濃度。如果注射部位發生不良壞死，或標記太強烈，請將濃度降低至 2%溶液。如果您需要使用更精確的測量方法，氟金的分子量為(wei) 532.6 道爾頓。

5.染料管理

·A.壓力注射 -這可能是常用的應用模式。注射量範圍為(wei) 0.05-1 μl，通常為(wei) 0.1-0.2 ml。

B.離子電滲療法 --通過 4-10 秒脈衝(chong) 離子電滲療法(+5 至 +10ua/10 分鍾)應用，可產(chan) 生離散、小注射部位。

C.晶體(ti) -示蹤劑晶體(ti) 可以通過微量移液器的頭端注入。

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6.術後存活期

觀察到良好的逆行標記，存活期從(cong) 兩(liang) 天到兩(liang) 個(ge) 月不等。存活期通常為(wei) 三到五天。較長的存活期可增強遠端突起的填充，而不會(hui) 使染料從(cong) 細胞中擴散。

7.固定

幾平任何固定劑都可以使用，也可以不用固定劑，通常使用含4%用醛的磷酸鹽中性緩衝(chong) 鹽水。含有高濃度重金屬(如鋨、示)的固定劑會(hui) 淬滅熒光，而高濃度(超過1%)的戊二醛可能會(hui) 增加背景熒光

8.組織化學處理

含有熒光金的組織幾乎可以根據任何常見的組織學技術進行處理。這包括未固定組織的低溫切片(10mm)、固定組織的冷凍切片(20um)以及從(cong) 嵌入塑料(0.2-4 mm)或石蠟(3-10 mm)的組織中切下的薄切片。固定組織的冷凍切片*常用。

9.組合方法

在此處理階段，可對切片進行進一步處理以獲得第二種標記物，例如放射自顯影、HRP組織化學、免疫細胞化學、第二種熒光示蹤劑、熒光複染劑等。

10.封片、透明化和蓋玻片

切片通常封片在明膠包被的載玻片上，風幹，浸入二甲苯中，並用無熒光 DPX塑料封片劑蓋玻片。切片可用分級酒精脫水，除非這與(yu) 第二種示蹤劑不兼容。如果要將 Fluoro-Gold 與(yu) 熒光免疫細胞化學相結合，則切片要風幹，並用中性緩衝(chong) 中甘油(1:2)直接蓋玻片。

11.檢查和攝影

熒光金可使用帶寬帶紫外線激發濾光片的熒光顯微鏡進行可視化。當用中性 pH 緩衝(chong) 液處理組織時，會(hui) 發出金色，而當用酸性(例如pH 3.3)pH 緩衝(chong) 液處理組織時，會(hui) 發出藍色。可以用數碼或膠片拍攝(彩色照片使用 Ektachrome 200-400 ASA膠片，黑白照片使用速度相當的膠片，例如 Tri-X)。大多數曝光時間範圍為(wei) 10-60 秒，具體(ti) 取決(jue) 幹物鏡放大倍數和標記強度。三十 (80)秒曝光時間約為(wei) 平均值。可以利用多次曝光同時可視化熒光金和另一種示蹤劑。因此，紫外線與(yu) 明場照明相結合，可在放射自顯影中同時定位熒光金與(yu) HRP或銀顆粒。同樣，藍光激發也可結合使用，以品現 FITC,的綠色發射顏色，而綠色激發光可用於(yu) 同時觀察碘化丙啶或溴化乙錠(熒光複染劑)的紅色發射顏色。

載體(ti)

對於(yu) 通過微量注射器或微量移液器進行壓力注射，應將氟金溶解在蒸餾水或 0.9%鹽水中。氟金也可用作 0.2M 中性磷酸鹽緩衝(chong) 液中的懸浮液，但懸浮顆粒可能會(hui) 堵塞細小的微量移液器頭端，因此蒸餾水或 0.9%鹽水是載體(ti) 。對於(yu) 離子電滲療法，在 0.1M 醋酸鹽緩衝(chong) 液(pH=3.3)中配製 1% 氟金溶液。清潔幹淨的(95%乙醇、水)玻璃微量移液器頭端應為(wei) 10-20 mm。最佳離子電滲療法參數為(wei) +1 至 +5u 安培，脈衝(chong) 電流(開啟 4-10 秒，關(guan) 閉 4-10 秒)持續 10-20 分鍾。

注射部位

幾乎任何中樞或周圍神經係統結構都可以注射熒光金，以分析逆向運輸。在周圍神經係統中，可以研究神經節和周圍靶標。對於(yu) 周圍神經的研究，應切斷或損壞神經，然後將其浸入或注射5%的熒光金溶液中。由於(yu) 完整的通道纖維不能大量吸收熒光金，因此必須切斷或嚴(yan) 重損壞纖維才能吸收染料。

運輸和生存時間

熒光金被用作逆向軸突示蹤劑，盡管確實存在順向軸突運輸。存活時間應該有所不同(尤其是 12 小時-2 天的非常短的存活時間)，以最大限度地提高所研究的特定神經係統中的順向運輸。對幹逆向運輸，存活時間應該從(cong) 4天到 14 天不等。7到 10 天適用於(yu) 大多數係統，盡管長通路(例如脊髓到腦幹)和大型哺乳動物(例如貓、猴子)的通路可能需要更長的存活時間(例如 14 天)。此外，由於(yu) 熒光金在逆向標記的神經元內(nei) 保持快速，因此數月的存活時間也會(hui) 產(chan) 生優(you) 異的效果。對於(yu) 離子電滲療法，建議存活時間為(wei) 2-5天。據估計，哺乳動物每天的運輸速度約為(wei) 2厘米;對於(yu) 冷血動物來說，它的速度比較慢。

組織處理

組織處理在使用指南和原始出版物中有詳細介紹(Schmued and Fallon，1986，Brain Research 877:147-154)。由於(yu) 熒光金在許多溶劑中都很穩定，並且在逆向標記的神經元中保持穩定，因此它的使用與(yu) 許多組織化學技術兼容。它可以與(yu) 其他逆向示蹤劑、免疫熒光、PAP 和 ABC免疫細胞化學、HRP組織化學、放射自顯影、複染(溴化乙錠是*選的熒光複染)、石蠟包埋和塑料包埋一起使用。但是，如果組織未固定，在水溶液中對組織進行額外處理超過一兩(liang) 個(ge) 小時將導致標記神經元的熒光金熒光消失。熒光金可能在電子顯微鏡中有用。熒光金可用於(yu) 已切片並轉移到磷酸鹽緩衝(chong) 液的大腦。切片通常安裝在明膠包被的載玻片上，風幹，浸入二甲苯中，並用 DPX塑料封片劑蓋上(FLUKA Chemical Corp.,255 Oser Avenue，Hauppauge，NewYork，11788，目錄號44581)。組織也可以在載玻片上觀察而無需進一步處理，可以通過分級酒精進行脫水，或者，對於(yu) 免疫細胞化學，可以將切片風幹並直接用中性緩衝(chong) 中甘油(1:2)蓋上。

檢查和攝影使用寬帶紫外線(UV)激發濾光片，在熒光顯微鏡下觀察熒光金。使用與(yu) 在寬帶紫外線下激發的其他熒光逆行示蹤劑相同的濾光片組(例如，真藍、快藍、核黃)，例如 Leitz Ploem 濾光片係統 A(寬帶紫外線、激發濾光片 BP 340-380)、鏡麵 RKP 400、屏障濾光片 1P430)。應專(zhuan) 門為(wei) 熒光顯微鏡製作物鏡(例如蔡司製造的物鏡)、甘油或水。由於(yu) 塑料會(hui) 吸收紫外線，因此不建議通過塑料培養(yang) 皿等觀察。推薦的膠片是 T-Max(柯達，黑白)和 Ektachrome 200(柯達，彩色幻燈片)。曝光時間通常為(wei) 20 秒到 1.5分鍾。

Fluoro-Gold (Fluorogold)是 Fluorochrome,LLC 的*家產(chan) 品。它由 Fluorochrome 銷售，自1985 年以來被廣泛使用。其他公司正在銷色他們(men) 聲稱與(yu) Fluoro-Gold 相同或等同的產(chan) 品。這些化合物的化學結構與(yu) Fluoro-Gold 不同，並且這些化合物的某些物理性質可能非常不同。

“注意:熒光金、熒光金抗體(ti) 和熒光紅寶石僅(jin) 供安驗室研光動物或體(ti) 外試驗研究使用。不可用於(yu) 人體(ti) 。這些藥物應僅(jin) 供定期從(cong) 事神經解部學研充和體(ti) 外試驗或僅(jin) 用於(yu) 安驗室研充的動物的人員使用。

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