RNApure Reagent

RNApure（TRIzol）是廣譜型總RNA提取試劑。實驗操作快速方便，顏色鮮明，便於(yu) 分層。本試劑適用範圍廣泛，可以從(cong) 動物組織、植物材料、各種微生物及培養(yang) 細胞等 樣品中提取總RNA。樣品在RNApure中被充分裂解的同時能夠***限度地保證RNA的完整性。在加入氯仿離心後，溶液會(hui) 分成三層：上層無色水相、中間層和下層紅色有機相， RNA分布在上清層中。收集上清層後，經異丙醇沉澱便可以回收得到總RNA。提取的總 RNA完整性好，無蛋白和DNA汙染，可用於(yu) 各種分子生物學常規實驗，如RT-PCR、 Real-time RT-PCR、Northern Blot、Dot Blot、體(ti) 外翻譯等。

自備試劑氯仿(新開封或提取 RNA 專(zhuan) 用)、無水乙醇。操作步驟1．各種材料的處理1）植物組織：取新鮮植物組織在液氮中充分研磨或將植物組織剪碎後直接在 RNApure中迅速研磨，每 30-50 mg 組織加入 1ml RNApure，渦旋混勻。注意：樣品體(ti) 積一般不要超過 RNApure 體(ti) 積的 10%。2）動物組織：取新鮮或-70℃凍存的動物組織盡量剪碎，每 30-50mg 組織加入 1mlRNApure，勻漿儀(yi) 進行勻漿處理。或在液氮中研磨後加入 1ml RNApure 混勻。注意：樣品體(ti) 積一般不要超過 RNApure 體(ti) 積的 10%。3）單層培養(yang) 細胞：吸去培養(yang) 液，可直接在培養(yang) 板中加入適量 RNApure（每 10cm²麵積需要 1ml RNApure），用取樣器反複吹打使細胞裂解。也可用胰蛋白酶處理後，將細胞溶液轉移至 Rnase-free 的離心管中，13000×g 離心 5 分鍾，收集細胞沉澱，仔細吸除所有上清，加入 1ml RNApure 混勻。注意：a. 收集細胞數量不要超過 1×10⁷。b. RNApure 加量根據培養(yang) 板麵積決(jue) 定，不是由細胞數決(jue) 定。如果 RNApure 加量不足，可能導致提取的 RNA 中有 DNA 汙染。c. 收集細胞時一定要將細胞培養(yang) 液去除幹淨，否則會(hui) 導致裂解不全，造成 RNA 的產(chan) 量降低。4）細胞懸液：離心收集細胞。每 5×10⁶-1×10⁷動物、植物和酵母細胞或每 10⁷細菌細胞加入 1 ml RNApure。注意：a. 加入 RNApure 前不要洗滌細胞，以免 RNA 降解。b. 一些酵母和細菌細胞可能需要勻漿儀(yi) 或液氮研磨處理。5）血液處理：直接取新鮮的血液，加入 3 倍體(ti) 積 RNApure（推薦 0.25ml 全血加入 0.75mlRNApure），充分振蕩混勻。6）可選步驟：對於(yu) 蛋白、脂肪、多糖或胞外物質含量高的樣品，如肌肉組織、脂肪組織或植物的塊莖，可以在勻漿處理後 4℃，13,000×g 離心 10 分鍾以除去不溶物質，此時沉澱中含胞外物質、多糖和高分子量的 DNA，而 RNA 存在於(yu) 上清中。2．樣品中加入 RNApure 後反複吹打幾次，使樣本充分裂解。室溫放置 5 分鍾，使蛋白核酸複合物*全分離。3．以每 1ml RNApure 加入 200ul 氯仿的比例加入氯仿，蓋好管蓋，劇烈振蕩 15 秒，室溫放置 2 分鍾。4．4℃ 13,000×g 離心 10 分鍾，此時樣品分為(wei) 三層：紅色有機相，中間層和上層無色水相，RNA 主要在上層水相中，將上層水相移到一個(ge) 新的 Rnase-free 離心管（自備）中。5．在得到的水相溶液中加入等體(ti) 積異丙醇，顛倒混勻，室溫放置 10 分鍾。6．4℃ 12,000×g 離心10分鍾，棄上清。7．加入75%乙醇（用Rnase-free Water配製）洗滌沉澱。每使用1ml RNApure用1ml75%乙醇對沉澱進行洗滌。8．4℃ 12,000×g 離心3分鍾，小心吸棄上清，注意不要吸棄RNA沉澱。注意：剩餘(yu) 的少量液體(ti) 可短暫離心，然後用槍頭吸出，注意不要吸棄沉澱。9．室溫放置 2-3 分鍾，晾幹。加入 30-100ul Rnase-free Water，充分溶解 RNA，得到的RNA 保存在-70℃，防止降解。注意：沉澱不要過分幹燥，以免難於(yu) 溶解。

適用範圍:RNA 提取保存條件：2-8℃