bioworlde Ni-IDA 瓊脂糖 6B

bioworlde  Ni-IDA 瓊脂糖 6B

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Ni-IDA 瓊脂糖凝膠 6B BD0052-2

產(chan) 品名稱：
Ni-IDA Sepharose 6B

應用：
Biogot TM Ni-IDA sepharose 6B 比其他 Ni-IDA 固定了更多的 Ni2+（看起來更藍）。我們(men) 的 Ni-IDA 每毫升可以偶聯更多的蛋白質。我們(men) 的產(chan) 品由 GE Sepharose CL 凝膠製成。Sepharose 的交聯形式在化學和物理上比 Sepharose 本身更具耐受性，提供相同的選擇性和更好的流動特性。交聯 Sepharose 凝膠對有機溶劑具有耐受性，因此是在有機溶劑中分離的選擇

背景：
通過固定化金屬親(qin) 和層析 (IMAC) 純化組氨酸標記的重組蛋白越來越受歡迎。鎳 (Ni2+) 是 IMAC 純化中常用的金屬離子。Ni-IDA Sepharose 6B 由 90 μm 高度交聯的瓊脂糖珠組成，其中固定有螯合配體(ti) 。然後該螯合基團帶有鎳 (Ni2+) 離子。與(yu) 其他鎳親(qin) 和層析相比，Ni-IDA 具有更高的蛋白結合能力。它具有低 Ni2+ 泄漏，並與(yu) 蛋白質純化中使用的各種添加劑兼容。其高流量特性使其非常適合放大和重力流柱純化。

備用名稱 ：
推薦的緩衝(chong) 液：非變性條件：結合/洗滌緩衝(chong) 液：20 mM Tris-HCl、500 mM NaCl、5 mM 咪唑，pH 8.0。洗脫緩衝(chong) 液：20 mM Tris-HCl、500 mM NaCl、500 mM 咪唑，pH 8.0。變性條件：結合/洗滌緩衝(chong) 液：20 mM Tris-HCl、8 M 尿素、500 mM NaCl、5 mM 咪唑，pH 8.0。洗脫緩衝(chong) 液：20 mM Tris-HCl、8 M 尿素、500 mM NaCl、500 mM 咪唑，pH 8.0。注意：為(wei) 獲得最佳純度和產(chan) 量，樣品和緩衝(chong) 液中所需的咪唑最佳濃度因蛋白質而異。在非變性條件下，結合緩衝(chong) 液中的 20-40 mM 咪唑適用於(yu) 許多蛋白質。洗脫緩衝(chong) 液中的 500 mM 咪唑通常足以洗脫目標蛋白。再生培養(yang) 基 注意：如果要純化相同的蛋白質，則不必在每次純化之間剝離介質；根據細胞提取物體(ti) 積、目標蛋白等，在 5-7 次純化後重新填充培養(yang) 基就足夠了。要重新填充 Ni-IDA Sepharose 6B，首先去除殘留的 Ni2+，用 5 倍柱體(ti) 積的 20 mM 磷酸鈉，0.5 M 洗滌NaCl，50 mM EDTA，pH 7.4。用至少 5 倍柱體(ti) 積的結合緩衝(chong) 液洗滌，然後用 5 倍柱體(ti) 積的蒸餾水洗滌，然後再對柱進行充電，以去除殘留的 EDTA。要對水洗柱進行充電，請在蒸餾水中加載 0.5 個(ge) 柱體(ti) 積的 0.1 M Ni2SO4。也可以使用其他金屬的鹽、氯化物或硫酸鹽。用 5 柱體(ti) 積的蒸餾水清洗，然後用 5 柱體(ti) 積的結合緩衝(chong) 液（以調節 pH 值）清洗，然後儲(chu) 存在 20% 乙醇中。根據細胞提取物體(ti) 積、目標蛋白等，在 5-7 次純化後重新填充培養(yang) 基就足夠了。要重新填充 Ni-IDA Sepharose 6B，首先去除殘留的 Ni2+，用 5 倍柱體(ti) 積的 20 mM 磷酸鈉，0.5 M 洗滌NaCl，50 mM EDTA，pH 7.4。用至少 5 倍柱體(ti) 積的結合緩衝(chong) 液洗滌，然後用 5 倍柱體(ti) 積的蒸餾水洗滌，然後再對柱進行充電，以去除殘留的 EDTA。要對水洗柱進行充電，請在蒸餾水中加載 0.5 個(ge) 柱體(ti) 積的 0.1 M Ni2SO4。也可以使用其他金屬的鹽、氯化物或硫酸鹽。用 5 柱體(ti) 積的蒸餾水清洗，然後用 5 柱體(ti) 積的結合緩衝(chong) 液（以調節 pH 值）清洗，然後儲(chu) 存在 20% 乙醇中。根據細胞提取物體(ti) 積、目標蛋白等，在 5-7 次純化後重新填充培養(yang) 基就足夠了。要重新填充 Ni-IDA Sepharose 6B，首先去除殘留的 Ni2+，用 5 倍柱體(ti) 積的 20 mM 磷酸鈉，0.5 M 洗滌NaCl，50 mM EDTA，pH 7.4。用至少 5 倍柱體(ti) 積的結合緩衝(chong) 液洗滌，然後用 5 倍柱體(ti) 積的蒸餾水洗滌，然後再對柱進行充電，以去除殘留的 EDTA。要對水洗柱進行充電，請在蒸餾水中加載 0.5 個(ge) 柱體(ti) 積的 0.1 M Ni2SO4。也可以使用其他金屬的鹽、氯化物或硫酸鹽。用 5 柱體(ti) 積的蒸餾水清洗，然後用 5 柱體(ti) 積的結合緩衝(chong) 液（以調節 pH 值）清洗，然後儲(chu) 存在 20% 乙醇中。為(wei) Ni-IDA Sepharose 6B 充電，首先去除殘留的 Ni2+，用 5 倍柱體(ti) 積的 20 mM 磷酸鈉、0.5 M NaCl、50 mM EDTA，pH 7.4 洗滌。用至少 5 倍柱體(ti) 積的結合緩衝(chong) 液洗滌，然後用 5 倍柱體(ti) 積的蒸餾水洗滌，然後再對柱進行充電，以去除殘留的 EDTA。要對水洗柱進行充電，請在蒸餾水中加載 0.5 個(ge) 柱體(ti) 積的 0.1 M Ni2SO4。也可以使用其他金屬的鹽、氯化物或硫酸鹽。用 5 柱體(ti) 積的蒸餾水清洗，然後用 5 柱體(ti) 積的結合緩衝(chong) 液（以調節 pH 值）清洗，然後儲(chu) 存在 20% 乙醇中。為(wei) Ni-IDA Sepharose 6B 充電，首先去除殘留的 Ni2+，用 5 倍柱體(ti) 積的 20 mM 磷酸鈉、0.5 M NaCl、50 mM EDTA，pH 7.4 洗滌。用至少 5 倍柱體(ti) 積的結合緩衝(chong) 液洗滌，然後用 5 倍柱體(ti) 積的蒸餾水洗滌，然後再對柱進行充電，以去除殘留的 EDTA。要對水洗柱進行充電，請在蒸餾水中加載 0.5 個(ge) 柱體(ti) 積的 0.1 M Ni2SO4。也可以使用其他金屬的鹽、氯化物或硫酸鹽。用 5 柱體(ti) 積的蒸餾水清洗，然後用 5 柱體(ti) 積的結合緩衝(chong) 液（以調節 pH 值）清洗，然後儲(chu) 存在 20% 乙醇中。用至少 5 倍柱體(ti) 積的結合緩衝(chong) 液洗滌，然後用 5 倍柱體(ti) 積的蒸餾水洗滌，然後再對柱進行充電，以去除殘留的 EDTA。要對水洗柱進行充電，請在蒸餾水中加載 0.5 個(ge) 柱體(ti) 積的 0.1 M Ni2SO4。也可以使用其他金屬的鹽、氯化物或硫酸鹽。用 5 柱體(ti) 積的蒸餾水清洗，然後用 5 柱體(ti) 積的結合緩衝(chong) 液（以調節 pH 值）清洗，然後儲(chu) 存在 20% 乙醇中。用至少 5 倍柱體(ti) 積的結合緩衝(chong) 液洗滌，然後用 5 倍柱體(ti) 積的蒸餾水洗滌，然後再對柱進行充電，以去除殘留的 EDTA。要對水洗柱進行充電，請在蒸餾水中加載 0.5 個(ge) 柱體(ti) 積的 0.1 M Ni2SO4。也可以使用其他金屬的鹽、氯化物或硫酸鹽。用 5 柱體(ti) 積的蒸餾水清洗，然後用 5 柱體(ti) 積的結合緩衝(chong) 液（以調節 pH 值）清洗，然後儲(chu) 存在 20% 乙醇中。

分類 :
蛋白質相關(guan) 試劑

形式：
液體(ti)

含量 :
6% 瓊脂糖

儲(chu) 存和保質期：
Ni-IDA Sepharose 6B 有 2、10、25 和 100 ml 實驗室包裝可供選擇，以滿足不同的要求。培養(yang) 基在 4°C 至 30°C 的 20% 乙醇中儲(chu) 存更長時間。

程序 ：
樣品製備：以下方案已在我們(men) 的實驗室中成功使用，但其他既定程序也可能適用。1. 用於(yu) 在大腸杆菌或酵母細胞質中表達的蛋白質。稀釋細胞糊：每克細胞糊加入5-10 ml 結合緩衝(chong) 液。樣品和結合緩衝(chong) 液必須含有相同濃度的咪唑，以防止宿主細胞蛋白與(yu) 暴露的組氨酸結合。同時，去除大顆粒和高濃度試劑，如 EDTA、氨基酸和還原劑，這會(hui) 破壞 Ni-IDA 樹脂。2. 酶促裂解：0.2 mg/ml 溶菌酶、20 µg/ml DNAse、1 mM MgCl2、1 mM PMSF（終濃度）或其他蛋白酶抑製劑。抑製劑必須對 Ni 樹脂的能力沒有影響。然後在 +4°C 下攪拌 30 分鍾。3. 機械裂解：超聲處理，均化、反複冷凍/解凍或類似技術。4. 將裂解物的 pH 值調節至 pH 7.4：請勿使用強堿或強酸調節 pH 值（沉澱風險）。5. 離心裂解物：轉移到管中並在室溫或 +4°C 下以 12000rpm 離心 20 分鍾，具體(ti) 取決(jue) 於(yu) 蛋白質的敏感性。6. 收集上清液並進行純化。7. 酵母、昆蟲或哺乳動物表達係統分泌到培養(yang) 基中的蛋白，如果上清液量大，用硫酸銨沉澱法濃縮蛋白，用1×PBS透析，然後上柱，如果是位培養(yang) 上清液不含 EDTA、組氨酸或任何其他可能影響 Ni 柱的還原劑，可直接上樣到柱上。筆記：您也可以將未澄清的樣品應用到色譜柱（即省略上麵的第 5 步）。如果是這樣，稍微延長機械裂解時間，例如超聲處理 10 分鍾。由於(yu) 未澄清樣品的粘度較高，總純化時間將增加。純化程序： 1. 柱準備。(a) 輕輕顛倒瓶子數次，使樹脂懸浮，以混合漿料。(b) 使用移液器將適當體(ti) 積的 Ni 樹脂漿液轉移到柱中。讓樹脂沉降，讓存儲(chu) 緩衝(chong) 液從(cong) 柱子中流出。(c) 用四床體(ti) 積的結合/洗滌緩衝(chong) 液平衡柱子或直到 A280 穩定。2. 純化蛋白質 (a) 將蛋白質結合到樹脂上。將上述含有 His 標記蛋白的可溶性澄清樣品以每分鍾 0.5-1 毫升的流速應用於(yu) 柱子。收集並保存流經以供分析。(b) 洗滌。用八床體(ti) 積的結合/洗滌緩衝(chong) 液洗滌柱子或直到 A280 在每分鍾 1 毫升的流速下穩定。(c) 目標蛋白的洗脫。用五到十床體(ti) 積的洗脫緩衝(chong) 液洗脫多組氨酸標記的蛋白質。根據目標蛋白的具體(ti) 應用，收集洗脫物並在 20 mM Tris-HCl pH 8.0 或 1×PBS，pH 7.4 中透析。3. 在變性條件下從(cong) 大腸杆菌中純化多組氨酸標記蛋白（主要在包涵體(ti) 中表達）： (a) 在 1× PBS 中重懸細胞沉澱（每 ml 沉澱約 5 ml），並通過超聲破碎細胞如上所述。(b) 將裂解物以 12,000 rpm 離心 10 分鍾，收集包涵體(ti) 。必要時用 1× PBS 清洗包涵體(ti) 數次。(c) 將包涵體(ti) 溶解在結合/洗滌緩衝(chong) 液中（每 ml 沉澱約 5 ml），並在室溫下孵育 30-60 分鍾。可能需要均質化或超聲處理才能溶解沉澱。(d) 以 12,000 rpm 的速度離心 30 分鍾以去除任何殘留的不溶性物質。小心地將上清液轉移到幹淨的管中，不要幹擾顆粒，並將其加載到用結合/洗滌緩衝(chong) 液預平衡的 Ni 柱上。(e) 用結合/洗滌緩衝(chong) 液洗滌柱子 3-4 次，直到 280 nm 處的吸收接近於(yu) 零。(f) 用最小體(ti) 積的洗脫緩衝(chong) 液洗脫。注意：此處推薦的過程是從(cong) 包涵體(ti) 中純化蛋白質，此過程洗脫的蛋白質可能需要重新折疊以獲得活性和可溶性蛋白質。並在室溫下孵育 30-60 分鍾。可能需要均質化或超聲處理才能溶解沉澱。(d) 以 12,000 rpm 的速度離心 30 分鍾以去除任何殘留的不溶性物質。小心地將上清液轉移到幹淨的管中，不要幹擾顆粒，並將其加載到用結合/洗滌緩衝(chong) 液預平衡的 Ni 柱上。(e) 用結合/洗滌緩衝(chong) 液洗滌柱子 3-4 次，直到 280 nm 處的吸收接近於(yu) 零。(f) 用最小體(ti) 積的洗脫緩衝(chong) 液洗脫。注意：此處推薦的過程是從(cong) 包涵體(ti) 中純化蛋白質，此過程洗脫的蛋白質可能需要重新折疊以獲得活性和可溶性蛋白質。並在室溫下孵育 30-60 分鍾。可能需要均質化或超聲處理才能溶解沉澱。(d) 以 12,000 rpm 的速度離心 30 分鍾以去除任何殘留的不溶性物質。小心地將上清液轉移到幹淨的管中，不要幹擾顆粒，並將其加載到用結合/洗滌緩衝(chong) 液預平衡的 Ni 柱上。(e) 用結合/洗滌緩衝(chong) 液洗滌柱子 3-4 次，直到 280 nm 處的吸收接近於(yu) 零。(f) 用最小體(ti) 積的洗脫緩衝(chong) 液洗脫。注意：此處推薦的過程是從(cong) 包涵體(ti) 中純化蛋白質，此過程洗脫的蛋白質可能需要重新折疊以獲得活性和可溶性蛋白質。000 rpm 30 分鍾以去除任何殘留的不溶性物質。小心地將上清液轉移到幹淨的管中，不要幹擾顆粒，並將其加載到用結合/洗滌緩衝(chong) 液預平衡的 Ni 柱上。(e) 用結合/洗滌緩衝(chong) 液洗滌柱子 3-4 次，直到 280 nm 處的吸收接近於(yu) 零。(f) 用最小體(ti) 積的洗脫緩衝(chong) 液洗脫。注意：此處推薦的過程是從(cong) 包涵體(ti) 中純化蛋白質，此過程洗脫的蛋白質可能需要重新折疊以獲得活性和可溶性蛋白質。000 rpm 30 分鍾以去除任何殘留的不溶性物質。小心地將上清液轉移到幹淨的管中，不要幹擾顆粒，並將其加載到用結合/洗滌緩衝(chong) 液預平衡的 Ni 柱上。(e) 用結合/洗滌緩衝(chong) 液洗滌柱子 3-4 次，直到 280 nm 處的吸收接近於(yu) 零。(f) 用最小體(ti) 積的洗脫緩衝(chong) 液洗脫。注意：此處推薦的過程是從(cong) 包涵體(ti) 中純化蛋白質，此過程洗脫的蛋白質可能需要重新折疊以獲得活性和可溶性蛋白質。(e) 用結合/洗滌緩衝(chong) 液洗滌柱子 3-4 次，直到 280 nm 處的吸收接近於(yu) 零。(f) 用最小體(ti) 積的洗脫緩衝(chong) 液洗脫。注意：此處推薦的過程是從(cong) 包涵體(ti) 中純化蛋白質，此過程洗脫的蛋白質可能需要重新折疊以獲得活性和可溶性蛋白質。(e) 用結合/洗滌緩衝(chong) 液洗滌柱子 3-4 次，直到 280 nm 處的吸收接近於(yu) 零。(f) 用最小體(ti) 積的洗脫緩衝(chong) 液洗脫。注意：此處推薦的過程是從(cong) 包涵體(ti) 中純化蛋白質，此過程洗脫的蛋白質可能需要重新折疊以獲得活性和可溶性蛋白質。

研究用途：
僅(jin) 供研究使用，不得用於(yu) 診斷程序。

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