ImmuQuest抗體：C4d補體片段單克隆抗體

免疫熒光實驗方案 - 甲醛固定

1. 從(cong) Tcunit 收集細胞，並使用吸力從(cong) 培養(yang) 皿中取出培養(yang) 基。

2. 用 1x PBS 清洗並去除。

3. 將細胞在預溫 (37°C) 多聚甲醛中在定軌搖床上室溫孵育 12 分鍾。

4. 除去PFA並在1x PBS中的0.5% Triton X-100中在室溫下孵育5分鍾。

5. 準備封閉試劑，這也是抗體(ti) 稀釋液。

6. 在室溫下用 1x PBS 洗滌細胞 2x，在軌道搖床上洗滌 4 分鍾/洗滌。

7. 用 1% NCS 和 1x PBS 在室溫下封閉 30 分鍾。

8. 準備一抗（50μl/蓋玻片）和濕染色室。

9. 在室溫下用 lx PBS 清洗細胞 2x，並短暫風幹。

10. 在染色室中、黑暗中、室溫下與(yu) 一抗一起孵育 1 小時。在此期間準備二抗。

11. 用 1x PBS 清洗細胞 5 次（更換燒杯 5 次/每個(ge) 燒杯計數 5 次）

12. 在染色室中、黑暗中、室溫下與(yu) 二抗一起孵育 1 小時。

13. 用 1x PBS 清洗細胞 5x。

14. 坐於(yu) 大皮。

溶液（染色當天新鮮配製）。

• * 1x 磷酸鹽緩衝(chong) 鹽水。

• * 封閉試劑：1% NCS，溶於(yu) 1x PBS（使用新鮮的 10x PBS）。

• * 固定液：3.5% 多聚甲醛。

1.75g PFA 溶於(yu) 20 ml d.H2O 加 5 滴 1M NaOH 中。在 50-60°C 的熱板上攪拌直至溶解。添加 4 滴 HCl 並檢查 pH 指示條。 PH值應為(wei) 7.4。用 d.H2O 補足體(ti) 積至 25ml，並添加 25ml 2xPBS。添加到蓋玻片之前檢查 pH 值。

免疫熒光實驗方案 - 甲醇/丙酮固定

1. 從(cong) TCunit 收集細胞，並使用吸力從(cong) 培養(yang) 皿中取出培養(yang) 基。

2. 用 1x PBS 清洗並去除。

3. 用冷甲醇:丙酮 1:1 在冰上固定細胞 10 分鍾。

4. 準備封閉劑，這也是抗體(ti) 的稀釋劑。

5. 除去固定劑並在室溫下用1x PBS洗滌細胞3x，在定軌搖床上洗滌4分鍾/洗滌。

6. 在 RT 下用 1% NCS 和 1x PBS 封閉 30 分鍾。

7. 準備一抗（50μl/蓋玻片）和濕染色室。

8. 在 RT 下用 1 x PBS 清洗細胞 2x，並風幹約 7 分鍾。

9. 在染色室中在黑暗中與(yu) 一抗一起在室溫下孵育 1 小時。在此期間準備二抗。

10. 用 1x PBS 清洗細胞 5 次（更換燒杯 5 次/每個(ge) 燒杯計數 5 次）

11. 在染色室中在黑暗中與(yu) 二抗一起在室溫下孵育 1 小時。

12. 用 1x PBS 清洗細胞 5x。

13. 坐於(yu) 大皮。

溶液（染色當天新鮮配製）

• * 1x 磷酸鹽緩衝(chong) 鹽水。

• * 封閉試劑：1% NCS 溶於(yu) 1x PBS（使用新鮮的 10x PBS）。

• * 固定液：甲醇:丙酮 1:1 冰冷。

蛋白質印跡實驗方案

1. 將凝膠轉移到 PDVF 或硝酸纖維素膜上

2. 將膜放入塑料托盤中，並在封閉緩衝(chong) 液中攪拌一小時

3. 在洗滌緩衝(chong) 液中衝(chong) 洗

4. 在洗滌緩衝(chong) 液加一抗中孵育一小時

5. 用洗滌緩衝(chong) 液洗滌 6 X 5 分鍾

6. 在加二抗的洗滌緩衝(chong) 液中孵育一小時

7. 用洗滌緩衝(chong) 液洗滌 6X 5 分鍾

8. 檢測（例如 ECL、Amersham 根據製造商說明）

洗滌緩衝液

PBS + 0.1% 吐溫 20

封閉緩衝液

洗滌緩衝(chong) 液+5%奶粉

所用抗體(ti) 的濃度取決(jue) 於(yu) 每種抗體(ti) 、抗原的量和所用的檢測方法。一般來說，稀釋度在幾百倍到幾千倍稀釋範圍內(nei) ，但通常必須憑經驗確定。