使用 ProteOrange 進行蛋白質凝膠染色

ProteOrange 染料可以在聚丙烯酰胺凝膠中電泳後快速、輕鬆地可視化蛋白質。 ProteOrange 是一種二苯乙烯型熒光團，含有兩(liang) 性離子片段。在核酸、多糖和其他分子存在的情況下，蛋白質/十二烷基硫酸鈉膠束 (SDS) 選擇性地結合染料。 ProteOrange 可有效對分子量為(wei) 6 kDa 及以上的蛋白質進行染色。在三個(ge) 數量級覆蓋的濃度範圍內(nei) ，熒光信號與(yu) 蛋白質濃度呈線性關(guan) 係。

ProteOrange 凝膠染色的靈敏度大約是考馬斯染色的十倍，但不如銀染色敏感。對於(yu) ProteOrange，檢測限為(wei) 每條帶 3 ng 蛋白質（考馬斯的檢測限約為(wei) 30 ng，銀染的檢測限約為(wei) 0.5 ng）。然而，與(yu) 銀染相比，ProteOrange 染色的方案要簡單得多，因為(wei) 它不需要洗滌，也不需要標準 SDS-PAGE 的固定。實驗流程需要 30-60 分鍾才能完成，包括在含有染料的 7.5% 乙酸水溶液中孵育凝膠，以及用 7.5% 乙酸短暫衝(chong) 洗凝膠 30 秒。應使用波長為(wei) 312-365 nm 的透射儀(yi) 進行可視化。 ProteOrange 庫存溶液在室溫下避光保存。

協議

1. 確保染料原液不含沉澱物。如果不是這種情況，請將試劑在 70 °C 下保持幾分鍾，直至沉澱物全溶解，然後搖動小瓶。

2. 準備染料的工作溶液。準備的量取決(jue) 於(yu) 凝膠塊的大小和托盤尺寸。例如，25 mL 的溶液足以製備 10 × 15 cm 的凝膠片。要製備此溶液，請將 1.88 mL 冰醋酸溶解在 23 mL 水中，製成 7.5% 乙酸，並添加 5 μl 5000x ProteOrange 溶液。攪拌均勻，避光保存不超過三小時。

3. 電泳結束後，將凝膠放入托盤中，加入染料工作液，避光孵育20-60分鍾（對於(yu) 較薄的凝膠或較低百分比的凝膠，應縮短時間；對於(yu) 1 mm的凝膠，60分鍾最佳厚，15% 凝膠）。染料的工作溶液隻能使用一次，因為(wei) 重複使用會(hui) 導致靈敏度降低。

4. 用 7.5% 乙酸溶液（不含染料）衝(chong) 洗凝膠 30 秒。凝膠已準備好進行可視化。

5. 為(wei) 了可視化，將凝膠放在透照儀(yi) 上。

6. 要去除染料，請將凝膠在 0.1% Tween 20 溶液中孵育 10-12 小時，或用 7.5% 乙酸溶液反複清洗。

筆記

• 為(wei) 了提高靈敏度，我們(men) 建議在 TGB 緩衝(chong) 液中添加 0.05% SDS（相對於(yu) 標準 0.1%）進行電泳。 SDS 濃度的這種變化不會(hui) 影響蛋白質的遷移率，但會(hui) 縮短染色時間。

• 在含有甲醇/乙醇的溶液中染色之前不要固定凝膠。

• 對於(yu) 小蛋白質或低百分比凝膠，應選 10% 乙酸溶液。

• 該染料不適用於(yu) 將蛋白質轉移到膜上後對其進行染色。

• 如果凝膠用於(yu) 蛋白質印跡，ProteOrange 染色可以在標準轉運緩衝(chong) 液中進行，但這會(hui) 導致靈敏度下降。

• 對於(yu) Triton X-100 凝膠電泳，電泳完成後立即在 Triton X100 不含 TGB 緩衝(chong) 液中清洗凝膠（3×20 分鍾），然後不久將凝膠在添加了 0.05% SDS 的 TGB 緩衝(chong) 液中孵育 30 分鍾，然後進行染色。

• 為(wei) 了在電泳過程中對蛋白質進行染色，ProteOrange 應溶解在上層（陰極）緩衝(chong) 液中。電泳結束後，將凝膠在 7.5% 乙酸溶液中孵育 30 分鍾，以降低熒光背景水平。

• 無需 SDS 即可對凝膠進行染色，但該方法的靈敏度會(hui) 降低，並且靈敏度很大程度上取決(jue) 於(yu) 蛋白質的氨基酸組成。除非電泳後應回收天然蛋白質，否則凝膠應在含有 0.05% SDS 的緩衝(chong) 液中孵育，並根據標準方案進行染色。

• 通常，預染色的蛋白梯用 ProteOrange 進一步染色時不會(hui) 發出熒光。僅(jin) 使用未染色的梯子。

• 用 ProteOrange、考馬斯染色或銀染色後仍然可以進行。