酪酰胺信號放大

該酪酰胺信號放大 (TSA) 方案可用於(yu) 通過免疫染色或 原位雜交檢測過氧化物酶標記樣品中的信號。所有孵育均在搖床上進行。

試劑：

• 2-4% 甲醛，pH 7.4

• 磷酸鹽緩衝(chong) 液 (PBS)，pH 7.4

• PBT：0.1% Tween-20； PBS，pH 7.4

• 1 mM 疊氮*鈉的 PBT 溶液

• 30 % H2O2

• 1 mg/ml熒光標記酪酰胺，標記 級 DMSO

可選：

• 硫酸葡聚糖 (DS)

• 4-碘苯酚

• 酸性甘氨酸緩衝(chong) 液：0.1 M 甘氨酸； pH 2.0； 0.1% 吐溫-20

協議：

1. 按要求的方式固定樣品。通常，用冷的 2-4% 甲醛（pH 7.4）進行固定。用磷酸鹽緩衝(chong) 液（PBS，pH 7.4）和PBT （0.1% Tween-20；PBS，pH 7.4）清洗固定劑中的樣品。

2. 通過將樣品在 抑製溶液（PBT 中的 1 mM 疊氮*鈉）中室溫孵育 30-60 分鍾來抑製內(nei) 源過氧化物酶活性。

可選。可以使用 PBT 中的 3% H 2 O 2或 0.02 N HCl代替 1 mM 疊氮*鈉進行抑製。對於(yu) 後續的免疫化學，該階段可以與(yu) 阻斷抗體(ti) 的非特異性結合相結合。為(wei) 此，必須將封閉血清或 1% BSA 添加到疊氮化物或 H 2 O 2 溶液中。

筆記！如果背景較低且進行原位雜交，則可以跳過此步驟；直接進入步驟4。

3. 在室溫下，在 PBT 中孵育 3 次，每次 10 分鍾，從(cong) 抑製溶液中清洗樣品。

4. 執行所有免疫化學或 原位雜交步驟，用過氧化物酶偶聯抗體(ti) 標記樣品。

5. 室溫下在 PBT 中孵育 3 次，每次 10 分鍾，清洗樣品以去除抗體(ti) 。

6. 使用前立即製備反應緩衝(chong) 液。為(wei) 此，用 30% H 2 O 2將 PBT 稀釋兩(liang) 次，每次 1:100，直至最終濃度為(wei) 0.003% (1:10000)。

可選。為(wei) 了提高方法的靈敏度，可以將以下組分添加到反應混合物中（單獨或組合）：

• 2% 硫酸葡聚糖 (DS) 用於(yu) 增加反應混合物的粘度。

• 500 µg/ml 4-碘苯酚用於(yu) 增強過氧化物酶反應。以 1:200 稀釋儲(chu) 備液（100 mg/ml 乙醇溶液）使用更方便。

7. 將 1 至 10 μg/ml標記的酪酰胺添加到反應緩衝(chong) 液中（最佳濃度必須通過實驗確定）。通過搖動混合。

8. 將樣品與(yu) 反應緩衝(chong) 液在黑暗中室溫孵育 5-30 分鍾（確切時間通過實驗確定；可以以 15 分鍾為(wei) 起點）。

9. 將樣品在抑製劑溶液（1 mM 疊氮*鈉的 PBT 溶液）中在室溫下避光孵育 10 分鍾來終止反應。

10. 用 PBS 清洗樣品 3 次，每次 10 分鍾。

11. 要重複抗體(ti) -TSA 標記周期，請在室溫下用酸性甘氨酸緩衝(chong) 液（0.1% Tween-20；0.1 M 甘氨酸，pH 2.0）處理樣品 10 分鍾。該過程分離抗原結合的抗體(ti) ，而不影響與(yu) 蛋白質共價(jia) 結合的酪酰胺。

12. 使用封固劑將樣品封固在蓋玻片下 。