神經酰胺是鞘脂的前體，由鞘氨醇和脂肪酸通過酰胺鍵連接而成。 BDP 神經酰胺是合成的熒光脂質，是 BDP 熒光團與鞘氨醇的綴合物。在細胞內部，BDP 神經酰胺融入高爾基體膜中，因此這些染色劑廣泛用於細胞生物學，通過熒光顯微鏡觀察活細胞和固定細胞中的高爾基體。

溶液的製備

1.1 庫存解決方案

BDP FL 神經酰胺：

• 將 50 μg BDP FL 神經酰胺溶解在 87.2 μL DMSO 中，以獲得 1 mM 儲(chu) 備溶液。

• 將 250 μg BDP FL 神經酰胺溶解在 436 μL DMSO 中，以獲得 1 mM 儲(chu) 備溶液。

BDP TMR 神經酰胺：

• 將 50 μg BDP TMR 神經酰胺溶解在 73.6 μL DMSO 中，以獲得 1 mM 儲(chu) 備溶液。

• 將 250 μg BDP TMR 神經酰胺溶解在 368 μL DMSO 中，以獲得 1 mM 儲(chu) 備溶液。

BDP TR 神經酰胺：

• 將 50 μg BDP TR 神經酰胺溶解在 70.8 μL DMSO 中，以獲得 1 mM 儲(chu) 備溶液。

• 將 250 μg BDP TR 神經酰胺溶解在 354 μL DMSO 中，以獲得 1 mM 儲(chu) 備溶液。

將儲(chu) 備溶液儲(chu) 存在-20°C或-80°C避光條件下。避免反複凍融循環。

1.2 染色液

1. 將 10 mL 的 Hanks 緩衝(chong) 鹽溶液與(yu) 10 mM HEPES (HBSS/HEPES)、pH 7.4 測量到 50 mL 塑料管中。其他無血清平衡鹽溶液，例如 PBS，也適用於(yu) 此目的。

（可選）將 1 mM Ca 2+和 0.5 mM Mg 2+添加到緩衝(chong) 溶液中，以防止活細胞聚集並從(cong) 玻璃上分離。

2. 在裝有緩衝(chong) 液的試管中添加 3.4 mg (0.34 mg/mL) 脫脂 BSA。

3. 添加 200 µL 1 mM 神經酰胺庫存溶液，以獲得 5 µM 神經酰胺/5 µM BSA 工作溶液。神經酰胺的稀釋取決(jue) 於(yu) 細胞類型和密度，應通過實驗確定。

所得神經酰胺/BSA複合物溶液可在-20°C下儲(chu) 存在塑料瓶中。

細胞染色

2.1 活細胞

1. 在無菌蓋玻片上培養(yang) 細胞。貼壁細胞可以直接在蓋玻片上染色。

2. 從(cong) 蓋玻片中吸出介質。

3. 用適當的介質（例如 HBSS/HEPES）衝(chong) 洗細胞。

4. 將細胞與(yu) 5 µM 神經酰胺/BSA 溶液在 4°C 下孵育 30 分鍾。

5. 用冰冷的培養(yang) 基衝(chong) 洗細胞幾次。

6. 用脫脂 BSA (0.34 mg/ml) 的 HBSS/HEPES 溶液在室溫下衝(chong) 洗細胞四次，持續 30 分鍾。

7. 將細胞在新鮮培養(yang) 基中於(yu) 37°C 進一步孵育 30 分鍾。

8. 用新鮮培養(yang) 基衝(chong) 洗細胞。

9. （可選）染色細胞可在 4% 甲醛中於(yu) 4 °C 固定 2 分鍾。在 PBS 中清洗固定細胞兩(liang) 次。

10. 對於(yu) 熒光顯微鏡，將帶有染色細胞的蓋玻片翻轉到載玻片上，將它們(men) 放置在載玻片和蓋玻片之間。

2.2 固定單元格

1. 4°C 下將細胞固定在 4% 甲醛中 5 分鍾。

2. 固定細胞用 PBS 清洗兩(liang) 次，每次 5 分鍾。

3. 將細胞與(yu) PBS 中的 5 µM 神經酰胺/BSA 在 4°C 下孵育 30 分鍾。

4. 用脫脂 BSA (0.34 mg/ml) 的 PBS 溶液在室溫下衝(chong) 洗細胞四次，持續 30 分鍾。

5. 在 PBS 中衝(chong) 洗細胞兩(liang) 次。

6. 對於(yu) 熒光顯微鏡，使用封固劑將細胞封固在蓋玻片下 。