免疫組織化學 (IHC) 故障排除

弱染色或無染色

抗體(ti) 濃度過低

• 嚐試增加一抗濃度

• 考慮使用使用生物素化二抗的擴增係統

抗體(ti) 不相容性

• 確保二抗與(yu) 一抗的物種和抗體(ti) 亞(ya) 類兼容

高背景會(hui) 模糊信號

• 請嚐試遵循下麵本故障排除指南的“高背景或非特異性染色"部分中詳細介紹的建議。

膜被透化試劑損壞

• 嚐試使用較低濃度的清潔劑。

• 嚐試使用較弱的清潔劑（例如用 Triton X-100 代替 Tween-20）

抗體(ti) 不適合 IHC

• 有些抗體(ti) 不適合 IHC 中抗原的呈現方式。檢查數據表，了解之前是否已在 IHC 或 ICC 中進行過測試，如果沒有，請考慮使用不同的抗體(ti) 。

• 嚐試使用不同的固定方法，該方法將以不同的方式呈現抗原，因此可能允許抗體(ti) 結合。

目標蛋白豐(feng) 度低

• 嚐試增加一抗濃度

• 嚐試使用放大方法，例如生物素化二抗

固定可能會(hui) 掩蓋目標表位

• 嚐試第 5.2 節中描述的抗原修複方法之一

抗體(ti) 對組織切片的滲透性較差

• 嚐試將抗體(ti) 孵育更長時間或以更高的濃度

• 嚐試使用更薄的組織切片

• 嚐試使用較小的一抗（例如使用 IgG 而不是 IgM）

通透性不足

• 嚐試增加緩衝(chong) 液中 Triton-X100 的濃度。

• 如果使用 Tween-20，請考慮改用 Triton-X100，這是一種更強的清潔劑。

與(yu) 檢測係統使用不兼容的二級熒光團

• 仔細檢查所使用的顯微鏡係統是否具有適合所使用熒光團的正確激發和發射濾光片。

• 考慮使用不同的熒光團偶聯二抗。幾乎所有熒光顯微鏡至少都配備濾光片組，能夠對 DAPI 和 FITC / Alexa Fluor 488 / Dylight 488 進行成像。

安裝後熒光團降解

• 免疫熒光切片封片後 2 天內(nei) 對切片進行成像。

緩衝(chong) 區退化

• 使用前檢查緩衝(chong) 液的 pH 值

• 警惕細菌生長的跡象，一旦發現就扔掉。

• 必要時新鮮製作。

降解的一抗

• 確保抗體(ti) 在製造商提供的最佳使用日期內(nei) 。

• 考慮將來分裝抗體(ti) ，快速冷凍，然後儲(chu) 存在 -80°C 下，以避免抗體(ti) 降解的風險。

由於(yu) 光漂白而損壞熒光團共軛二抗

• 確保使用熒光團共軛二抗時執行的所有步驟都是在弱光或黑暗中進行

• 成像時盡量使用盡可能低的照明來捕獲最佳圖像。這對於(yu) 共焦顯微鏡尤其重要，因為(wei) 高激光功率設置可以極快地漂白一些熒光團。

• 考慮使用比 FITC 或 TRITC 等舊化合物更耐漂白的熒光團。

不兼容的緩衝(chong) 區

• 一些抗體(ti) 在基於(yu) TBS 的緩衝(chong) 液中表現更好，而其他抗體(ti) 則更喜歡 PBS。嚐試更換緩衝(chong) 液，看看這是否會(hui) 增加染色。 

過度固視

• 嚐試減少組織與(yu) 固定劑一起孵育的時間。

• 考慮嚐試替代固定液

多路複用時在通道之間滲透

重疊的熒光團激發/發射光譜

• 嚐試使用重疊有限的熒光團對（例如DAPI、Alexa Fluor 488 和 Alexa Fluor 594）

• 使用光譜分析工具（例如FPbase Spectraviewer）確保熒光團對之間的重疊有限。

• 嚐試使用單一抗體(ti) 對照，看看一個(ge) 通道中的信號是真實的還是隻是由於(yu) 滲漏所致。

• 一些先進的圖像分析軟件具有可以（在一定程度上）校正滲色的功能。

成像係統上的激發和發射濾光片不合適

• 檢查熒光團和濾光片之間的兼容性，以確保每個(ge) 濾光片僅(jin) 捕獲熒光團。

• 對於(yu) 共焦顯微鏡，請考慮收緊允許進入檢測器的光波長窗口並使用測序，以便每個(ge) 熒光團隻有一個(ge) 激光處於(yu) 活動狀態。

組織形態改變

冰傷(shang) 害

• 確保在未來的實驗中按照既定方案（例如本文件中列出的方案）冷凍組織。將組織切片放入 30% 蔗糖中時，確保組織已全沉沒，否則蔗糖可能沒有足夠的時間擴散到組織中。

• 考慮在分析中引入損傷(shang) 評分係統，以評估冰損傷(shang) 是否影響實驗結果。 

自由浮動部分的粗暴處理

• 使用網等設備可以幫助減少整個(ge) 協議中組織切片所需的處理量。

• 使用優(you) 質細畫筆拾取和移動部分。確保沒有被低溫恒溫器/切片機刀片降解。

• 安裝自由浮動部分時，盡量避免接觸部分，而是使用刷子飄到載玻片上。

因儲(chu) 存不當而降解

• 如果保存不當，切片可能會(hui) 被微生物生長汙染。考慮使用 0.05% 疊氮hua鈉來防止儲(chu) 存溶液或冷凍切片中的生長

抗原修複過於(yu) 苛刻

• 考慮將抗原修複方法改為(wei) 不太苛刻的方法

冰凍切片從(cong) 載玻片上脫落

• 確保始終對載玻片進行處理，以確保切片更有效地粘貼。雖然有商業(ye) 品種，但可以按照CSH 協議等既定協議在實驗室中對載玻片進行替換； 

固定不佳

• 不全固定會(hui) 導致組織迅速降解。嚐試增加組織與(yu) 固定劑一起孵育的時間或考慮增加固定劑的濃度。

高背景或非特異性染色

組織切片中的自熒光分子

• 如果組織尚未灌注，請考慮在下一個(ge) 實驗中進行，因為(wei) 剩餘(yu) 的紅細胞會(hui) 產(chan) 生強烈的自發熒光。

• 自發熒光可能是由固定劑引起的。嚐試使用不同的固定劑。

• 確保 NaBH 4是新鮮製備的

• 嚐試用淬滅熒光的染料（例如，Pontamine 天藍、蘇丹黑或台盼藍）孵育切片。

• 嚐試使用與(yu) 自發熒光波長不同的熒光團（例如紅移染料，如 Alexa Fluor 680） 

非特異性二次結合

• 運行無初級對照以評估次級對照是否與(yu) 組織切片結合。

• 如果一抗與(yu) 組織來自同一物種，這可能會(hui) 導致重大問題。請參閱本協議或考慮使用不同種類的一抗。 

一抗濃度過高

• 嚐試降低一抗濃度

二抗濃度過高

• 嚐試降低二抗的濃度。我們(men) 發現 1:300 至 1:500 的稀釋度是一個(ge) 不錯的起點。

抗體(ti) 純化不充分

• 未純化的多克隆抗體(ti) 可能含有與(yu) 一係列非靶蛋白發生交叉反應的抗體(ti) 。檢查數據表；理想情況下，應使用免疫原作為(wei) 誘餌，通過親(qin) 和層析純化多克隆抗體(ti) 。 

• 雖然單克隆抗體(ti) 的問題較少見，但仍應至少使用 Protein A 或 G 親(qin) 和層析進行純化。

• 如果有其他替代品，請考慮改用更好的純化抗體(ti) ，或者如果沒有其他替代品，請考慮內(nei) 部純化抗體(ti) 。  

阻擋不足

• 確保封閉血清與(yu) 培養(yang) 二抗的物種相同。

• 嚐試使用不同的阻塞解決(jue) 方案。

• 嚐試增加封閉步驟的長度或增加血清濃度

洗滌不足

• 嚐試增加洗滌的時間和/或次數。

• 確保洗滌期間有足夠的攪拌，以幫助未結合的抗體(ti) 擴散出組織

一抗與(yu) 組織切片來自同一物種。

• 運行無初級對照以評估次級對照是否與(yu) 組織切片結合。

• 如果一抗與(yu) 組織來自同一物種，這可能會(hui) 導致重大問題。請參閱本協議第 4.3 節或考慮使用不同種類的一抗。

內(nei) 源酶活性（用於(yu) 顯色檢測）

• 嚐試用特定抑製劑阻斷內(nei) 源酶活性。

對於(yu) HRP 結合二抗，使用 0.3% H 2 O 2 10-15 分鍾。如果在此濃度下封閉不成功，請考慮增加至 3%。 

對於(yu) AP 結合二抗，請使用 2mM 左旋咪唑。 

部分已經幹了

• 確保切片始終保持濕潤，並在加濕室中使用載玻片安裝方案進行長時間孵育。

底物過多（用於(yu) 顯色檢測）

• 嚐試降低底物濃度或孵育時間。

信號放大率過高（如果使用生物素化二抗）

• 嚐試降低擴增試劑或二抗的濃度。

• 考慮信號放大是否必要或者標準方法是否有效。

組織切片厚度

• 組織切片越厚，寬視野顯微鏡中的散射光越多。嚐試使用更薄的開關(guan) 部分或共焦顯微鏡。