分子克隆技巧簡介

分子克隆是分子生物學中用於(yu) 組裝重組DNA分子的一組實驗方法。

基於(yu) 質粒的克隆包括 4 個(ge) 主要步驟：

• 插入 DNA 製備

• 載體(ti) DNA製備

• 插入片段與(yu) 載體(ti) 的連接

• 轉化為(wei) 感受態細胞

在下麵的示例中，我們(men) 將描述如何使用 SgfI 和 MluI 將目標插入片段亞(ya) 克隆到載體(ti) 中。

插入 DNA 製備

1. 對含有插入片段的載體(ti) 進行限製性消化

1. 用相應的限製性內(nei) 切酶消化含有插入片段的載體(ti) DNA。對於(yu) 我們(men) 的示例，使用的限製性位點是 SgfI 和 MluI 位點。 OriGene 擁有全基因組 cDNA 表達載體(ti) 。

2. 在瓊脂糖凝膠上運行消化的插入 DNA 以檢查大小並進行凝膠內(nei) 純化。
   OTI-TIP：在瓊脂糖凝膠上運行純化的消化插入片段以確認濃度。濃度將進一步有助於(yu) 建立連接。

2. 從(cong) 模板進行 PCR 擴增
   
   如果無法用兼容的限製性位點切割插入片段，則可以使用 PCR 來擴增插入片段，使其具有目標序列側(ce) 翼的所需克隆位點。

1. 設計包含目標序列側(ce) 翼所需克隆位點的引物。免費的在線軟件程序可用於(yu) 設計引物。如果手動設計，我們(men) 建議最小長度約為(wei) 20bp，GC含量為(wei) 40-60%，Tm為(wei) 60-65°C。

2. 通過 PCR 擴增模板中的插入 DNA。使用 PCR 純化試劑盒純化產(chan) 物。

3. 用限製性內(nei) 切酶消化 PCR 產(chan) 物。在瓊脂糖凝膠上運行消化的 PCR 並純化正確大小的 PCR 帶。
   OTI-TIP：在瓊脂糖凝膠上運行純化的 PCR 插入片段以確認濃度。濃度將進一步有助於(yu) 建立連接。

載體DNA製備

1. 選擇適合您的包含多個(ge) 克隆位點 (MCS) 的克隆載體(ti) 。 OriGene 擁有超過120 種哺乳動物表達載體(ti) ，包括病毒和非病毒形式。
   如果需要更多的載體(ti) DNA，可以使用熱休克或電穿孔方法轉化至大腸杆菌感受態細胞，例如DH5 alpha。

2. 用與(yu) 插入序列（例如 SgfI 和 MluI 位點）兼容的限製性酶消化 3-5 ug 載體(ti) 。將限製性消化酶在 37°C 下孵育 1 小時。
   OTI-TIP：可能需要更長的孵育時間以確保載體(ti) 全消化，但不要超過 3 小時。
   OTI-TIP：為(wei) 防止載體(ti) 自連接，請用堿性磷酸酶在 37°C 下將消化載體(ti) 的 5' 末端去磷酸化 30 分鍾。

3. 為(wei) 了減少未切割的載體(ti) 質粒背景，我們(men) 建議在瓊脂糖凝膠上運行消化的載體(ti) ，然後純化線性載體(ti) 。
   OTI-TIP：在瓊脂糖凝膠上運行純化的消化載體(ti) 以確認濃度。濃度將進一步有助於(yu) 建立連接。

結紮

1. 為(wei) 了成功連接，您可以使用載體(ti) ：插入片段摩爾比為(wei) 1:3。
   OTI-TIP： 1:1 和 1:10 之間的載體(ti) ：插入片段比例也可用於(yu) 進一步優(you) 化連接反應。

2. 要確定自連接產(chan) 生的任何背景克隆，請設置不含插入 DNA 的對照連接。

3. 在 16 oC 下孵育過夜（或根據連接試劑盒中的方案）。

轉型

1. 通過電穿孔或熱休克方法將 1-2 uL 連接反應轉化至大腸杆菌感受態細胞中。
   OTI-TIP：如果插入片段有毒或不穩定，則可以使用專(zhuan) 門允許這些插入片段成功擴增的感受態細胞。

2. 轉移至 SOC 培養(yang) 基中以複活轉化的細胞。在 37°C 下攪拌 SOC 介質 1-2 小時。

3. 將混合物接種到裝有抗生素平板的 LB 上，並在 37°C 下孵育過夜。
   OTI-TIP：對於(yu) 某些有毒插入物，可能需要較低的溫度和較長的孵育時間。較小的菌落可能是正確的克隆。

4. 篩選帶有目標插入序列的質粒的集落。通過消化、PCR 擴增和測序確認