蛋白質如何與羧化金納米顆粒的共價結合

金納米顆粒綴合物已廣泛應用於(yu) 生物研究和生物傳(chuan) 感應用。例如，金納米顆粒可以用作光學或電子顯微鏡、側(ce) 流免疫測定和免疫印跡方案（例如斑點印跡和蛋白質印跡）中的探針。 

製備金綴合物有兩(liang) 種方法，即被動吸附和通過連接體(ti) 的共價(jia) 偶聯。盡管製備過程相對簡單，但蛋白質對金納米顆粒的被動吸附並不能提供塗層的附著，因為(wei) 隨著時間的推移，分子可能會(hui) 從(cong) 表麵解吸。此外，在某些情況下，蛋白質在吸附到表麵後會(hui) 失去其特性，這可能是由於(yu) 三級結構的變化或活性位點/抗原結合位點與(yu) 金表麵的結合使其難以接近而引起的。

盡管存在這些缺點，蛋白質被動吸附到金納米顆粒上仍然很受歡迎，並且是生成蛋白質金綴合物的簡單方法。通過被動吸附到標準球形金納米粒子來製備金納米粒子蛋白綴合物，可以使用我們(men) 方便的被動吸附金綴合優(you) 化套件進行優(you) 化。

與(yu) 被動吸附相比，共價(jia) 偶聯將感興(xing) 趣的分子固定在功能化金納米顆粒上（例如帶有NHS、羧基或胺基團）。與(yu) 被動吸附方法相比，這種方法大大提高了蛋白質塗層的穩定性。共價(jia) 偶聯使用與(yu) 待綴合分子上的特定化學基團反應的化學接頭。因此，該方法比被動吸附方法更具特異性和可控性，並且可以針對特定應用優(you) 化共價(jia) 綴合配體(ti) 的數量。通過接頭的共價(jia) 偶聯還具有最小化空間位阻和對綴合蛋白三級結構的影響的優(you) 點。總而言之，這對綴合蛋白的性質產(chan) 生的有害影響較小。 

我們(men) 的羧基金納米粒子、羧基金納米海膽和羧基金納米棒均依賴於(yu) EDC/NHS 化學進行結合。 EDC 和 NHS“激活"顆粒表麵的羧基，形成中間體(ti) ，隨後與(yu) 特定蛋白質或其他待綴合配體(ti) 上的伯胺基團反應。EDC 綴合的效率通常較低，並且對 pH 值和共價(jia) 鍵敏感耦合協議需要一定程度的優(you) 化才能實現所需的性能或穩定性。 

以下方案提供了將生物分子與(yu) 我們(men) 的羧化金納米顆粒偶聯的一般指南，以標準 IgG 與(yu) 我們(men) 的 20 nm 羧基金納米顆粒的偶聯為(wei) 例。對於(yu) 其他生物分子或納米粒子類型的綴合，最佳綴合條件可能會(hui) 有所不同。為(wei) 了獲得與(yu) 顆粒表麵的最大結合，用於(yu) 結合的蛋白質的量比全覆蓋所需的理論量多大約1至10倍。 

所需材料和設備

• 20nm羧基金納米粒子 

• 甲基金納米粒子（陰性對照）

• 1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亞(ya) 胺鹽酸鹽 (EDC)（Sigma，目錄號 E1769）

• N-羥基磺基琥珀酰亞(ya) 胺 (Sulfo-NHS)（Sigma，目錄號 56485）

• 陽性對照蛋白：辣根過氧化物酶 (HRP) 或來自人血清的 IgG（Sigma，目錄號 I4506）

• 阻斷劑：牛血清白蛋白 (BSA)（Sigma，目錄號 A3059）

• 激活緩衝(chong) 液：2-(N-嗎啉代)乙磺酸 (MES) 緩衝(chong) 液（10 mM，pH 5.5）

• 偶聯緩衝(chong) 液：1X 磷酸鹽緩衝(chong) 鹽水 (PBS)

• 洗滌緩衝(chong) 液：1X 磷酸鹽緩衝(chong) 鹽水 + 0.05% Tween 20 (PBST)

• 紫外可見分光光度計

• 待綴合的目標蛋白

注意：待綴合的蛋白質必須是純淨的且不含汙染蛋白質（例如 BSA）和其他含胺成分。任何其他含有伯胺的分子都可能與(yu) 待綴合的蛋白質競爭(zheng) ，並可能導致綴合效率顯著降低。該蛋白質還應該具有足夠的可接近的伯胺基團用於(yu) 綴合。賴氨酸殘基是 EDC 綴合的主要靶位點。 

程序

1. 如果金納米粒子的濃度低於(yu) OD 50，則通過離心濃縮它們(men) 。如果緩衝(chong) 液中有顆粒，則通過離心在純水中清洗它們(men) 。有關(guan) 說明，請參閱“金納米顆粒處理和儲(chu) 存"。

2. 在 MES 緩衝(chong) 液中製備濃度分別為(wei) 30 和 36 mg/mL 的新鮮 EDC/NHS 混合溶液。請注意，EDC/NHS 在水溶液中會(hui) 迅速水解，應在結合前新鮮製備。

3. 取 10 µL 20 nm 金納米粒子（水中 OD 50）並與(yu) 步驟 2 中製備的 10 µL EDC/NHS 混合溶液混合。

4. 室溫孵育 30 分鍾

5. 添加 1 mL PBST 並渦旋 

6. 6,500 g 離心 30 分鍾

7. 除去大部分上清液

8. 添加 10 µL 抗體(ti) （1 X PBS 中 1 mg/mL）*

9. 在水浴超聲儀(yi) 中超聲 10 秒

10. 室溫下攪拌孵育 2 至 4 小時

11. 添加 1 mL PBST 並渦旋

12. 6,500 g 離心 30 分鍾

13. 除去大部分上清液

14. 添加 50 µL PBS 和 1% BSA

15. 儲(chu) 存於(yu) 4 度即可使用

* 蛋白質的濃度可能會(hui) 根據顆粒大小和要結合的蛋白質而變化。一般來說，蛋白質的量應比全表麵覆蓋的量多 1 至 10 倍。應估計顆粒的總表麵積和對接麵積，以計算最佳的蛋白質含量。下表是將 IgG 與(yu) 不同尺寸的羧基金顆粒結合的一般參考。其他蛋白質的計算類似，但需要計算您感興(xing) 趣的蛋白質的對接麵積。

表 I.  EDC 綴合期間不同尺寸的羧基金納米顆粒的 IgG 的建議量。 IgG 分子的對接麵積估計為(wei) 45 nm2。 “NX全覆蓋量"是指孵育量與(yu) 顆粒表麵全覆蓋所需量之間的過量比。