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CLiM™技術——CLiM™親和標簽係統簡介

更新時間:2023-12-27      點擊次數:1194

CLiM™親和標簽係統

CLiM  親(qin) 和標簽係統基於(yu) 兩(liang) 種小蛋白質之間形成的超高親(qin) 和力複合物。 CL7 (16 kDa) 是與(yu) 靶蛋白融合的標簽,lm7 (10 KDa) 是與(yu) 瓊脂糖樹脂偶聯的配體(ti) 。 

CL7 的 WT 版本是 CE7 DNase,一種有毒細菌蛋白。工程突變消除了其 DNA 結合和 DNAse 活性,同時保留了與(yu) lm7 的超高親(qin) 和力。

成分 

CL7標簽

CL7 標簽可以表達在目標蛋白的 N 或 C 末端。我們(men) 的質粒提供溶解度標簽、親(qin) 和標簽和切割位點的組合以及多種克隆選項。

在對照實驗中,CL7 對溶解度或表達沒有表現出負麵影響。事實上,當在沒有標簽的大腸杆菌中表達時,CL7 提高了原本不溶的蛋白質的表達水平和溶解度。當用 CL7 標簽表達時,一些臨(lin) 床和治療相關(guan) 的蛋白質從(cong) 不溶性部分轉移到可溶性部分。純化可溶表達的蛋白質不需要變性劑或包涵體(ti) 重折疊。這些蛋白質在基於(yu) 細胞的測定中表現出與(yu) 其他商業(ye) /臨(lin) 床樣品相同的生物活性。

 

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Im7樹脂

lm7 樹脂由固定在瓊脂糖樹脂上的 CL7 結合伴侶(lv) lm7 組成。 lm7 和 CL7 之間的高度特異性親(qin) 和力導致樹脂脫靶最小化。 35-40 mg/mL 的高樹脂結合能力可以捕獲大量 CL7 標記的蛋白質。 lm7 結構域具有高度彈性:使用 Gdn-HCI,樹脂可以再生並重複使用多達 100 次。

洗脫蛋白酶

蛋白酶對於(yu) 從(cong) lm7 樹脂柱上洗脫目標蛋白至關(guan) 重要。 TriAltus 生產(chan) 自己的高活性、超高親(qin) 和力純度的 SUMO 和 PSC 蛋白酶。這兩(liang) 種 TriAltus 蛋白酶的裂解速度比競爭(zheng) 對手的產(chan) 品更快,而且成本更低。 

例如,如果 60-80 mg 蛋白質與(yu) 5 mL 柱結合,則 1 mg 蛋白酶溶於(yu) 20 mL 洗脫緩衝(chong) 液中,流速為(wei) 0.2 mL/min,隻需 1.5-2 小時即可洗脫蛋白質。少量的蛋白酶太稀了,可能不需要去除。如果需要,可以使用用於(yu) SUMO 的鎳柱和用於(yu) PSC 的穀胱甘肽來執行拋光步驟。 

SUMO 

SUMO 蛋白酶用於(yu) 洗脫 N 末端標記蛋白。這種高度特異性的酶可識別 SUMO 結構域的三級結構並切割其 C 端,切割後不留下任何氨基酸殘基。其特異性使其切割速度比 PSC 更快。 4°C 下, 1  μg SUMO 在 30 分鍾內(nei) 將 2 mg 底物裂解 96%,在 40 分鍾內(nei) 裂解 99%。

PSC 

PSC 蛋白酶用於(yu) 切割 N 或 C 末端標記的蛋白質。它也非常高效:在 4 °C 下,20 μg PSC 將在 40 分鍾內(nei) 以 91% 的速度裂解 2 mg 底物,在 60 分鍾內(nei) 以 99% 的速度裂解 

一步層析純化方案 

CL7 和 Im7 的鹽獨立性和高度特異性的結合親(qin) 和力可實現簡單且簡化的實驗方案。 CL7 不是使用 His-trap 作為(wei) 第一步,然後使用特殊標簽來精煉蛋白質,而是通過一個(ge) 色譜步驟即可實現超高純度。

優點

蛋白質純化係統根據其在兩(liang) 個(ge) 參數下的性能進行評估:產(chan) 量和純度。  CLiM™  親(qin) 和標簽係統在兩(liang) 個(ge) 賬戶上的表現都優(you) 於(yu) His 標簽和特殊標簽。 

 

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屈服

TriAltus 的高結合能力樹脂的高效偶聯方法遠遠優(you) 於(yu) 其他專(zhuan) 用標簽的樹脂。 lm7 6B 樹脂的結合能力在 35-40 mg/mL 範圍內(nei) ,4B 樹脂的結合能力 >60 mg/mL。 

純度

蛋白質純化係統可達到的純度取決(jue) 於(yu) 其對未標記細胞成分的敏感性。雜質類型包括基於(yu) 標記靶蛋白/細胞成分相互作用的雜質以及由於(yu) 未標記細胞成分與(yu) 柱結合配體(ti) 的非特異性結合而產(chan) 生的雜質。 

與靶蛋白的相互作用

在高鹽濃度緩衝(chong) 液存在的情況下,CL7 與(yu) Im7 的結合不受幹擾。高鹽緩衝(chong) 液可在純化過程的早期去除雜質,以獲得潔淨的最終產(chan) 品。特殊標簽對約 0.2-0.3 M 的鹽濃度敏感,導致第一個(ge) 色譜步驟後純度較低。

非特異性結合

CL7 和 Im7 彼此具有高度的特異性。這可以防止標簽或配體(ti) 與(yu) 細胞成分(例如 DNA 和其他蛋白質)之間的非特異性相互作用。 IMAC 係統容易與(yu) 樹脂中的金屬離子發生非特異性結合。

高耐鹽性和高特異性結合的結合導致了如此高的純度,以至於(yu) CL7/lm7 係統僅(jin) 需要一個(ge) 色譜步驟。

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純化的具有挑戰性的蛋白質

多亞基RNA聚合酶-ttRNAP

ttRNAP(嗜熱菌RNA 聚合酶)是一種約 400 kDa 的大蛋白,具有 5 個(ge) 亞(ya) 基 ( α ββ'ω) 和 4 個(ge) 結合位點。傳(chuan) 統上,純化需要五個(ge) 連續的層析步驟才能獲得足夠高的純度以實現高活性。蛋白質純度與(yu) 其活性直接相關(guan) 。將細胞裂解物裝入 1.5 M 鹽緩衝(chong) 液中是一步純度的關(guan) 鍵。 CL7 標簽僅(jin) 附著在最大的 β' 亞(ya) 基上, 不會(hui) 幹擾亞(ya) 基組裝。 

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DNA/RNA 結合蛋白 - Cas9

Cas9是CRISPR技術的重要組成部分。 Cas9 活性與(yu) 其純度直接相關(guan) ,但通常需要 4-5 個(ge) 色譜步驟才能達到所需的純度。 Cas9 帶有 CL7 標簽並加載在 1.5 M 鹽緩衝(chong) 液中,一步純化即可達到 99% 的純度。該酶在細胞檢測和 體(ti) 外 檢測中均顯示出高活性。 

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膜蛋白-YidC

YidC 是一種~32 kDa 細菌膜整合酶。膜蛋白很難純化,因為(wei) 與(yu) 細胞成分的疏水接觸會(hui) 造成汙染。由於(yu) 組氨酸標簽非特異性地結合到其柱上,因此在一步純化後會(hui) 出現大量雜質。 CL7 對 Im7 的特異性最大限度地減少了這些影響,使純度高達 99%。

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折疊不良的治療蛋白 - GCSF、hGH 和 IFN- α

FDA 批準的三種生物製劑——GCSF、hGH 和 IFN-α——各自具有兩(liang) 個(ge) 內(nei) 部半胱氨酸橋,在沒有標簽的大腸杆菌中表達時通常不溶。純化不溶性蛋白質通常涉及棘手的重折疊步驟,然後是多個(ge) 色譜步驟。 CL7 增強蛋白質的表達、穩定性和折疊,使它們(men) 不再以包涵體(ti) 形式表達。這些蛋白質表現出與(yu) 基於(yu) 細胞的陣列中的其他商業(ye) /臨(lin) 床樣品相當的生物活性。 

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