蛋白質印跡 (WB) – 實驗方案

蛋白質印跡是一種常用的分子生物學技術，用於(yu) 分析樣品中感興(xing) 趣的蛋白質。細胞裂解物由細胞培養(yang) 物裂解產(chan) 生，並在凝膠電泳 (SDS-PAGE) 中按重量分離。然後這些蛋白質從(cong) 凝膠轉移到膜上，在膜上它們(men) 被封閉並用特異性抗體(ti) 探測以檢測感興(xing) 趣的蛋白質。借助靈敏且特異的抗體(ti) ，可以輕鬆檢測小樣品中的修飾蛋白質或未修飾蛋白質。

協議：

1. 在封閉液（TBST 中的 5% 脫脂牛奶（50mM Tris、100mM NaCl、0.05% Tween-20，pH 7.6）中振蕩孵育 1 小時，封閉膜。

注意：對於(yu) 磷酸化特異性抗體(ti) ，使用封閉液中的 5% BSA。

2. 在封閉液中以適當的稀釋度稀釋一抗。

3. 將膜與(yu) 稀釋的一抗在 40°C 下攪拌孵育過夜。

4. 去除抗體(ti) 溶液。室溫下在 TBST（50mM Tris、100mM NaCl、0.05% Tween-20、pH 7.6）中搖動洗滌膜 3 次，每次 5-10 分鍾。

注意：將 Tween-20 濃度增加至 0.1% 可降低背景並提高特異性，但會(hui) 降低靈敏度。

5. 將膜與(yu) 在封閉液中稀釋（根據製造商說明）的二級 AP 或 HRP 綴合物一起在室溫下振蕩孵育 1 小時。

6. 按照步驟 4 清洗膜。

7. 在進行化學發光反應之前，用 TBS 清洗膜 2-5 分鍾。

8. 根據製造商的說明製備和使用化學發光底物（用於(yu) AP 或 HRP）。

9. 立即包裹膜並在 X 射線膠片下曝光 10 秒至 1 小時。暴露時間可能根據抗體(ti) 和抗原的量而變化。或者放入成像儀(yi) 中並進行相應調整。