酸性 pH 調節劑如何影響快速色譜？

隨著反相快速色譜法在反應混合物純化中的使用增加，出現了很多問題，因為(wei) 許多化學家不像正相或矽膠柱色譜法那樣熟悉這項技術。化學家提出的問題之一是關(guan) 於(yu) pH 調節劑（特別是酸）的使用及其純化。

在反相占主導地位的 HPLC 領域，通常使用酸（甲酸、乙酸等），通常濃度為(wei) 0.1%。其基本原理是，如果樣品成分在溶液中可電離，則其色譜保留和峰形可能會(hui) 受到影響，並且其定量也會(hui) 受到挑戰。

電離/可電離化合物在溶液中時在帶電狀態和中性狀態之間保持平衡。這些分子在中性溶劑係統中進行色譜分析時，可以顯示為(wei) 前峰（想想滑雪坡），因為(wei) 電離部分比中性狀態更易溶於(yu) 水，因此洗脫得更快。添加 pH 調節劑，無論是酸還是堿，都可以迫使平衡全進入中性狀態或進入電離狀態。當全電離時，化合物會(hui) 提前洗脫；當中性時，該化合物更具疏水性，並且其在柱上的保留增強。

例如，我們(men) 來看看通過琥珀酸酐和 α-甲基苄胺的微波反應生成的合成 N-(1-苯乙基)琥珀酰亞(ya) 胺的純化，如圖 1 所示。

圖 1. 使用 Biotage® Initiator+ 微波反應器進行琥珀酸酐與(yu) α-甲基苄胺的反應

當使用中性溶劑純化時，產(chan) 品前沿很差，表明它處於(yu) 電離態和中性態之間的平衡，圖 2。

圖 2. 使用中性水和乙腈的反應混合物反相快速色譜顯示前沿產(chan) 物峰。

產(chan) 品作為(wei) 非高斯前沿峰洗脫的問題是，它是一個(ge) 寬廣的峰，並且收集在多個(ge) 柱體(ti) 積 (CV) 中。這意味著收集的產(chan) 物被稀釋在比典型或期望更多的溶劑中，這增加了蒸發餾分溶劑的體(ti) 積和時間，並增加了較低純度和回收率的可能性。事實上，該反應混合物中存在較早洗脫的副產(chan) 物，其汙染了早期產(chan) 物級分。是的，這些餾分可以被丟(diu) 棄，但這會(hui) 降低回收的產(chan) 品產(chan) 量，這不一定是理想的解決(jue) 方案。

通過將酸（在本例中為(wei) 0.2%冰醋酸）引入到水和乙腈中，可電離的反應混合物組分質子化。質子化產(chan) 物的洗脫帶減少（銳化），從(cong) 而增加了其濃度以及與(yu) 汙染副產(chan) 物的分離，圖 3。副產(chan) 物也質子化，導致其比中性流動相更早洗脫。結果是大大改善了分離，產(chan) 物以更集中的譜帶洗脫，並且與(yu) 副產(chan) 物的分離度更高。

圖 3. 使用酸化溶劑係統純化反應混合物，使產(chan) 物峰尖銳並降低幹擾副產(chan) 物的保留。

然而，化學家在使用 pH 值修改的流動相時需要小心，因為(wei) 潛在的化合物保留隨 pH 值變化而變化。在前麵的例子中，電離化合物移動是有幫助的，但質子化化合物並不總是朝著有利的方向移動。當 pH 值發生變化時，洗脫的化合物可能會(hui) 相互靠近甚至共洗脫。

我們(men) 可以看到這種情況發生在由靛紅酸酐和 α-甲基苄胺微波反應生成的合成產(chan) 物 2-氨基-N-(1-苯乙基)苯甲酰胺中，圖 4。

圖 4. 靛紅酸酐與(yu) α-甲基苄胺的微波反應

當使用中性水/甲醇梯度純化時，我們(men) 可以看到一些極性副產(chan) 物在產(chan) 品之前洗脫，以及強烈保留的副產(chan) 物在產(chan) 品後麵以 9.5 至 14 CV 之間的寬峰形式洗脫，圖 6。

圖 6. 反應混合物的 pH 中性反相快速色譜

在兩(liang) 種洗脫溶劑中添加 0.2% 冰醋酸後，洗脫化合物的保留率發生顯著變化。副產(chan) 物在中性 pH 值下以 4 CV 洗脫，在酸性條件下離子化並以 1.5 CV 洗脫。尾隨的疏水性副產(chan) 物也電離並移近產(chan) 物，圖 7。

圖 7. 使用酸化水/甲醇梯度純化反應混合物，改變了兩(liang) 種副產(chan) 物的保留。

隨著產(chan) 物和尾隨副產(chan) 物之間分辨率的降低，該反應純化的負載能力降低，這意味著需要更大的柱（和更多的溶劑）來充分純化反應產(chan) 物。

因此，雖然流動相 pH 值調整有助於(yu) 改善純化，但請注意，洗脫體(ti) 積和選擇性可能會(hui) 發生變化，從(cong) 而可能降低純化效率。

用於(yu) 創建此數據的設備包括：

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• Biotage®引發劑+微波反應器

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• Biotage® Selekt Single 快速色譜係統

• Biotage® Sphere C18 色譜柱，12 克