Duolink® PLA實驗方案

一、封閉

1.渦旋Duolink®封閉液。

2.在每個(ge) 1cm2樣品上添加1滴（~40 μL）Duolink® 封閉液。確保封閉液要覆蓋整個(ge) 樣品。

3.將載玻片置於(yu) 加熱濕度箱中37℃孵育60分鍾。

二、孵育一抗在添加抗體(ti) 之前請勿讓載玻片幹燥，否則會(hui) 導致背景。

1.渦旋Duolink®抗體(ti) 稀釋劑。

2.在Duolink®抗體(ti) 稀釋劑中稀釋一抗或抗體(ti) 至合適濃度。

3.從(cong) 載玻片上彈掉Duolink®封閉液

4.將一抗溶液添加到每個(ge) 樣品中。

5.將載玻片置於(yu) 濕度箱中孵育。用最佳孵育溫度和時間孵育一抗。

三、孵育Duolink® PLA探針

1.渦旋PLUS和MINUS PLA探針

2.在Duolink®抗體(ti) 稀釋劑中以1:5稀釋PLUS和MINUS PLA探針。
對於(yu) 40 μL反應，取8 μL PLA探針MINUS原液，8 μL PLA探針PLUS原液和24 μL抗體(ti) 稀釋劑。為(wei) 所有樣品製備足量的溶液。

3.從(cong) 載玻片移除一抗溶液

4.在室溫下在1x洗滌緩衝(chong) 液A中洗滌載玻片2x 5分鍾。

5.移除多餘(yu) 的洗滌緩衝(chong) 液，然後塗抹PLA探針溶液。

6.將載玻片置於(yu) 預熱的濕度箱37℃孵育1小時。

四、連接
說明：連接酶要等到需要添加到樣品中時立即添加。確保連接緩衝(chong) 液在使用前解凍並充分混合。

1.用高純度純水以1:5稀釋5x Duolink® 連接緩衝(chong) 液並混合。
對於(yu) 40 μL反應，將8 μL 5x連接緩衝(chong) 液添加到32 μL高純度純水中。為(wei) 所有樣品製備足量的溶液。

2.從(cong) 載玻片移除PLA探針溶液。

3.在室溫下在1x洗滌緩衝(chong) 液A中洗滌載玻片2x 5分鍾。

 4.在洗滌過程中，使用冷凍座（-20°C）恢複從(cong) 凍箱裏取出的連接酶。

5.以1:40稀釋度將連接酶添加到步驟（a）中的1x連接緩衝(chong) 液中，並混合。
對於(yu) 40 μL連接溶液，將1 μL連接酶添加至39 μL的1x連接緩衝(chong) 液中。

6.移除多餘(yu) 的洗滌緩衝(chong) 液，然後塗抹連接溶液。

7.將載玻片置於(yu) 預熱的濕度箱37℃孵育30分鍾。

五、擴增
說明：聚合酶要等到需要添加到樣品中時立即添加。擴增緩衝(chong) 液對光敏感。避免所有含有擴增緩衝(chong) 液的溶液受到光照。

1.用高純度純水將5x擴增緩衝(chong) 液以1:5稀釋並混合。對於(yu) 40 μL反應，將8 μL 5x擴增緩衝(chong) 液添加到32 μL高純度純水中。為(wei) 所有樣品製備足量的溶液。

2.從(cong) 載玻片移除連接溶液。

3.在室溫下在1x洗滌緩衝(chong) 液A中洗滌載玻片2x 5分鍾。

4.在洗滌過程中，使用冷凍座（-20°C）恢複從(cong) 凍箱裏取出的聚合酶。

5.以1:80稀釋度將聚合酶添加到步驟（a）中的1x擴增緩衝(chong) 液中，並混合。

6.移除多餘(yu) 的洗滌緩衝(chong) 液，然後塗抹擴增溶液。

7.將載玻片置於(yu) 預熱的濕度箱37℃孵育100分鍾。

六、最終洗滌
說明：光敏試劑。始終避免保存載玻片。

1.從(cong) 載玻片上移除擴增溶液。

2.在室溫下在1x洗滌緩衝(chong) 液B中將載玻片洗滌2x 10分鍾。

3.在0.01x洗滌緩衝(chong) 液B中洗滌載玻片1分鍾。

七、準備成像
說明：含DAPI的Duolink原位封固劑是水性的，不會(hui) 凝固。可用幹淨的指甲油密封蓋玻片和載玻片的邊緣。避免在蓋玻片下製造氣泡。

1.拍掉載玻片上多餘(yu) 的洗滌緩衝(chong) 液。

2.使用最小體(ti) 積的含DAPI的Duolink原位封固劑，用蓋玻片蓋好載玻片。

3.等待15分鍾，然後在熒光或共聚焦顯微鏡中分析，使用至少20x物鏡。

4.成像後，可將載玻片在黑暗中4°C下保存最多4天，或者在-20°C下保存最多6個(ge) 月。