如何選擇染料

為(wei) 了使用熒光標記物獲得最佳結果，必須考慮幾個(ge) 因素。

首先，這是激發光源：為(wei) 了減少樣品自發熒光可能產(chan) 生的幹擾，激發波長優(you) 選在550 nm甚至600 nm以上。除了減少背景之外，紅色光譜範圍在處理活細胞時也具有優(you) 勢，因為(wei) 可以減少損傷(shang) 。

其次，熒光標記應在激發波長下具有強吸收以及高熒光量子產(chan) 率。消光係數和熒光量子產(chan) 率的乘積通常稱為(wei) 染料的“亮度"。

染料的熒光效率在光譜的藍色和綠色區域最高。在某些情況下，量子產(chan) 率幾乎達到100%的理論極限。對於(yu) 更長的波長，發射的量子產(chan) 率急劇下降，尤其是在水溶液中。然而， ATTO-TEC已成功開發出即使在 650 nm 下也具有高量子產(chan) 率的熒光標記。例如，ATTO 647N在水溶液中發出的熒光強度是舊花青染料 Cy5 ™的兩(liang) 倍。ATTO 647N和 Cy5 ™的相對熒光強度。PBS 水溶液1 cm 池中相應吸收最大值處的吸光度為(wei) 0.04。22 °C 時兩(liang) 個(ge) 吸收光譜（相同吸收）交叉處的熒光激發。

 
最後，標記物的發射光譜應與(yu) 所用濾光片組的傳(chuan) 輸相匹配。反過來，必須選擇濾光片組，使其阻擋樣品散射的激發光並允許熒光盡可能有效地通過。

當使用波長為(wei) 635 nm 的二極管激光器作為(wei) 激發源以及在 650 nm 至 750 nm 之間具有高透射率的濾光片組時，例如ATTO 647N將是一個(ge) 非常好的選擇。從(cong) ATTO染料列表可以看出， ATTO647N635 nm處具有高消光係數，接近吸收曲線最大值的波長，以及優(you) 異的熒光量子產(chan) 率（η fl = 65%）。

下表概述了一些常用的激勵源和推薦的ATTO標簽。
 

熒光標記物的特性
然而，應該注意的是，除了已經討論的光學考慮因素之外，選擇標記時其他因素也很重要，例如染料的 pH 依賴性光學和化學特性、其溶解度、光和化學特性穩定性、發色團的大小或連接體(ti) 的長度等，其涉及或滿足各自應用的要求。這些特性與(yu) 染料作為(wei) 熒光標記物的適用性非常相關(guan) 。

最重要的是，染料在照射過程中保持完整。許多常見的標記，例如熒光素衍生物 FITC，具有非常低的光穩定性。因此，當長時間觀察過程時，使用高強度激光激發時成像的靈敏度和質量會(hui) 受到限製。這對於(yu) 顯微鏡和其他基於(yu) 共焦原理的技術（例如單細胞的檢測）來說是一個(ge) 嚴(yan) 重的缺點。與(yu) 一些常用的舊染料相比，新型ATTO標簽的設計即使在長時間暴露後也顯著更加穩定。

ATTO 655與(yu) 傳(chuan) 統 Cy5的光穩定性比較TM在水裏。使用 250 W 鹵鎢燈照射，聚焦到 1 cm 池中。消光與(yu) 照射持續時間。

許多常見的熒光標記物即使在沒有照射的情況下（即在黑暗中）也會(hui) 分解，特別是當暴露於(yu) 實驗室大氣中的低濃度臭氧時。在相同的臭氧暴露條件下，染料ATTO 647N和ATTO 655的穩定性比花青染料 Cy5 TM和 Alexa647 TM長 100 倍。這在微陣列應用中非常重要，因為(wei) 染料分子位於(yu) 表麵，因此直接暴露在大氣中。

緊湊而強大的激光二極管現在覆蓋了光譜的整個(ge) 可見光和近紅外部分。它們(men) 已作為(wei) 非常有效的激發源進入許多應用/設備，並越來越多地取代傳(chuan) 統光源。

如果沒有最大吸收與(yu) 現有激發源的波長完*對應的標記，則應選擇波長稍長的染料。吸收會(hui) 稍微降低，但激發波長和熒光光譜之間的較大差異（與(yu) 激發波長無關(guan) ）具有在檢測過程中更好地分離散射激發光的優(you) 點。