大型共價連接熒光和金納米粒子免疫探針

FluoroNanogold™ 探針含有熒光標記和與(yu) 靶向分子共價(jia) 連接的Nanogold®簇，已成功用於(yu) 相關(guan) 熒光和電子顯微鏡 (EM) [1]。然而，納米金很小（1.4 nm），需要銀或金增強才能可視化[2]。與(yu) 較大的膠體(ti) 金製劑相比，這會(hui) 產(chan) 生更大的尺寸變異性。銀增強可能會(hui) 導致非特異性背景；銀可以通過四氧hua鋨 (OsO ₄ ) 固定進行化學蝕刻，導致信號丟(diu) 失[2]。我們(men) 已經製備了用於(yu) 相關(guan) 顯微鏡的共價(jia) 連接組合熒光探針和較大的金納米顆粒探針，可以通過電鏡直接觀察，無需自動金相增強。使用自組裝塗層對直徑為(wei) 2 nm 至 40 nm 的金納米顆粒進行穩定和功能化，該塗層包含疏水性螯合硫醇結構域，用於(yu) 將金表麵與(yu) 水介質密封，以及親(qin) 水性末端官能團（聚乙二醇，PEG），使金納米顆粒具有生物相容性。金納米粒子並實現位點特異性共價(jia) 探針綴合。這提供了高穩定性以及表麵特性和共軛反應的廣泛選擇。

5 nm 金納米顆粒的製備方法是，在增溶性非官能化硫醇和受保護的胺官能化硫醇的混合物存在下，用硼氫hua鈉直接還原金 (III) 鹽水溶液，然後使用蔗糖密度梯度 (10-30%) 進行純化超速離心（Ti-41 轉子，26,000 rpm，45 分鍾，5 ℃；距離頂部約 4 厘米的強烈紅色帶包含 5 nm 金）。通過在鹽酸甲醇中脫保護製備胺功能化的金顆粒。通過與(yu) 商業(ye) N-羥基琥珀酰亞(ya) 胺基-(NHS) Cy-5.5 熒光染料反應證明了特異性反應性。該綴合物通過 Superose-12 尺寸排阻色譜進一步純化（圖 1）。這種尺寸的不穩定顆粒會(hui) 被 0.1 M 氯化鈉沉澱，但即使在 1.0 M 氯化鈉溶液中，塗覆的顆粒仍保持分散和懸浮狀態。將它們(men) 反複離心並全重懸，不留下任何固體(ti) 沉澱；對常規蛋白質或大分子穩定的膠體(ti) 金綴合物進行相同的處理總是會(hui) 導致部分組分損失，形成無法重懸的不溶性沉澱。

通過將 NHS 和馬來酰亞(ya) 胺活化的 5 nm 金顆粒分別與(yu) 二抗分子 IgG 和 F(ab') 共價(jia) 連接來製備組合 5 nm 金-二抗 -Alexa Fluor 594 綴合物。然後，NHS 修飾的 Alexa Fluor 594 染料與(yu) 綴合物發生反應。使用蔗糖密度梯度超速離心純化產(chan) 物，然後如上所述進行凝膠過濾。使用抗兔-F(ab')綴合物作為(wei) 針對多克隆兔抗紅細胞抗體(ti) 的二級探針來標記懸浮液中的綿羊紅細胞，並使用 Nikon G-2A 濾光片組通過熒光顯微鏡觀察標記情況（圖2）。抗小鼠 IgG 綴合物用作二級探針，與(yu) 小鼠抗人 AE1/AE3 初級探針一起使用，在人扁桃體(ti) 組織中產(chan) 生清晰的細胞角蛋白染色（圖 3 ）。熒光金綴合物的相對量子產(chan) 率為(wei) 相應商業(ye) 染料標記二抗的 22-35%。