化學發光免疫分析（CLIA）技術的原理及應用

化學發光免疫分析法（CLIA）誕生於(yu) 1977年，根據放射免疫分析的基本原理，將高靈敏度的化學發光技術與(yu) 高特異性的免疫反應相結合而建立的化學發光免疫分析法。 CLIA具有靈敏度高、特異性強、線性範圍寬、操作簡單、不需要非常昂貴的設備等特點。

化學發光免疫分析是高靈敏度化學發光分析技術與(yu) 高特異性免疫反應的結合，用於(yu) 各種抗原、半抗原、抗體(ti) 、激素、酶、脂肪酸、維生素和藥物的檢測和分析。 。它是繼放射免疫分析、酶免疫分析、熒光免疫分析和時間分辨熒光免疫分析之後發展起來的最新免疫分析技術。

CLIA的應用範圍很廣，不僅(jin) 可以檢測不同分子大小的抗原、半抗原和抗體(ti) ，還可以用於(yu) 核酸探針的檢測。與(yu) 放射免疫分析（RIA）、熒光免疫分析（IFA）和酶免疫分析（EIA）相比，CLIA具有無輻射、標記物有效期長、全自動化等優(you) 點。 CLIA 為(wei) 獸(shou) 醫、醫學和食品分析測試和科學研究提供痕量或超痕量非同位素免疫分析。

一、化學發光免疫分析技術的基本原理

化學發光免疫分析包含免疫分析和化學發光分析兩(liang) 個(ge) 係統。免疫分析係統采用化學發光物質或酶作為(wei) 標記物，直接標記在抗原或抗體(ti) 上，通過抗原與(yu) 抗體(ti) 反應形成抗原抗體(ti) 免疫複合物。化學發光分析係統是在免疫反應後添加氧化劑或酶的發光底物。化學發光物質被氧化劑氧化後，形成處於(yu) 激發態的中間體(ti) ，該中間體(ti) 發射光子釋放能量回到穩定的基態。發光強度可以使用發光信號測量儀(yi) 來檢測。根據化學發光標記與(yu) 發光強度的關(guan) 係，可以使用標準曲線計算分析物的含量。

2. 化學發光免疫分析的類型

化學發光免疫分析根據標記物的不同可分為(wei) 三類，即化學發光免疫分析、化學發光酶免疫分析和電化學發光免疫分析。

2.1 化學發光免疫分析

化學發光免疫測定是一類用化學發光劑直接標記抗體(ti) 或抗原的免疫測定。目前常見的標記物主要是魯米諾和吖啶酯化學發光劑。

2.1.1 魯米諾標記化學發光免疫分析

魯米諾物質的發光是氧化反應發光。在堿性溶液中，魯米諾可被多種氧化劑氧化，其中常用的是H2o2。由於(yu) 發光反應速度慢，需要添加一些酶或無機催化劑。酶主要是辣根過氧化物酶（HRP），無機類有O3、鹵素和Fe3、Cu2、Co2及其複合物。

早期主要用於(yu) 無機和有機生物小分子的測定，因標記後發光強度下降而導致靈敏度降低。研究發現，在發光體(ti) 係中添加一些酚類及其衍生物、胺類及其衍生物、苯基硼酸衍生物，可以顯著增強體(ti) 係的發光能力，發光強度可提高1000倍，“背景"發光明顯降低，發光時間也延長。這些增強劑的使用使得化學發光免疫測定法能夠廣泛應用於(yu) 蛋白質和核酸分析領域。

2.1.2吖啶酯標記的化學發光免疫分析：吖啶酯由於(yu) 熱穩定性差而用於(yu) CLIA，通過研究合成了更穩定的吖啶酯衍生物。在H2o2和OH的條件下，吖啶酯類化合物可以快速發光，並且量子產(chan) 率很高。例如吖啶芳基酯的量子產(chan) 率可以達到0.05。采用吖啶酯作為(wei) 免疫分析的標記物，發光係統簡單。 、速度快、無需添加催化劑、標記效率高、背景低。這些特點引起了廣大分析診斷工作者的極大興(xing) 趣。

2.2 化學發光酶聯免疫分析

化學發光酶免疫分析（cLEIA）是酶免疫分析的一種，隻不過酶促反應的底物是發光劑。然後酶作用於(yu) 發光底物，在信號試劑的作用下發光，用發光信號分析儀(yi) 進行發光測量。

常用的標記酶有辣根過氧化物酶（HRP）和堿性磷酸酶（ALP），它們(men) 都有各自的發光底物。

常用的 HRP 發光底物是魯米諾及其衍生物。在CLEIA中，使用過氧化物酶標記的抗體(ti) ，進行免疫反應後，以魯米諾作為(wei) 發光底物，魯米諾在過氧化物酶和起始發光試劑（NaOH和H2o2）的作用下發光，酶免疫反應中酶的濃度該物質決(jue) 定化學發光的強度。這種傳(chuan) 統的化學發光體(ti) 係（HRP-H2O2-LUMINOL）在幾秒內(nei) 瞬時閃光，存在發光強度低、測量困難的缺點。後來在發光係統中添加了增強型發光劑，增強發光信號並保持較長時間的穩定，以利於(yu) 重複測量，從(cong) 而提高分析靈敏度和準確性。

堿性磷酸酶（ALP）已廣泛應用於(yu) 酶聯免疫分析和核酸雜交分析。堿性磷酸酶和1,2。由二氧雜環丁烷組成的發光體(ti) 係是目前化學發光體(ti) 係中最重要、靈敏的一類。此類係統的代表是ALP-AMPPD發光係統。 AMPPD在溶液中的磷酸鍵非常穩定，非酶水解非常緩慢。在pH12的0.05mol/L碳酸鈉緩衝(chong) 溶液中，分解半衰期可達74年，且幾乎不存在試劑本身的發光背景。 AMPPD是磷酸酶的直接發光底物，可用於(yu) 檢測堿性磷酸酶或抗體(ti) 、核酸探針和其他配體(ti) 的綴合物。 ALP-AMPPD發光係統具有非常高的靈敏度，標記物ALP的檢出限達到10-21mol，是靈敏的免疫分析方法之一。對AMPPD進行改進，得到反應動力學更好、靈敏度更高的新一代產(chan) 品：CSPD、CDP-Star。這些係統已廣泛應用於(yu) 各種基因和病原體(ti) DNA的鑒定。

2.3 電化學發光免疫分析

電化學發光（ECL）是指由電化學反應引起的化學發光過程。 ECL反應在電極表麵進行，發光底物為(wei) 三聯吡啶釕[Ru(byp)2+3]，三丙胺(TPA)用於(yu) 激發光反應。在陽極表麵，兩(liang) 種物質同時失去電子。在電極板上，Ru(byp)2+3 被氧化為(wei) Ru(byp)3+3，TPA 也被氧化為(wei) 陽離子自由基（TPA+#），TPA+# 自發釋放質子，成為(wei) 不穩定分子（TPA * ） ，將電子傳(chuan) 遞給 Ru(byp)3+3，形成激發態 Ru(byp)2+3。 Ru(byp)3+3在衰變時發射出波長為(wei) 620NM的光子，並返回到基態Ru(byp)2+3。這個(ge) 過程在電極表麵重複進行，產(chan) 生高效穩定的連續發光，並不斷增強。

ECL的突出優(you) 點是：

①標記物分子小，可實現多重標記，且標記物非常穩定；

②發光時間長、靈敏度高；

③光信號線性好，動態範圍寬，超過6個(ge) 數量級；

④ 可重複測量，重現性好；

⑤ 可實現多重檢測和均相免疫分析；

⑥速度快，通常隻需18分鍾即可完成一個(ge) 樣品的分析；

⑦全自動化。電化學發光免疫分析由於(yu) 其*性，是一種很有前景的免疫分析方法，越來越受到人們(men) 的重視。它已廣泛應用於(yu) 抗原、半抗原和抗體(ti) 的免疫檢測。

3. 申請

化學發光免疫分析（CLIA）和發光酶免疫分析（CLEIA）是化學發光免疫分析中常用的兩(liang) 種免疫分析方法。底物是發光劑的基礎。根據儀(yi) 器的檢測自動化程度，儀(yi) 器可分為(wei) 自動和半自動兩(liang) 種。目前國內(nei) 臨(lin) 床市場的全自動產(chan) 品大部分都是進口產(chan) 品；根據分離技術，儀(yi) 器分為(wei) 磁珠分離和塑料孔板分離兩(liang) 種。

化學發光免疫分析技術在檢驗醫學中有很多應用，包括腫瘤標誌物、心髒標誌物、甲狀腺功能、胰島素和C肽以及糖尿病、傳(chuan) 染病、骨代謝、細胞因子、激素、生長激素係統、貧血診斷和鑒別診斷、過敏反應等和監測治療藥物濃度。