流式細胞儀參數測量原理

流式細胞儀(yi) 是一種對細胞進行自動分析和分選的設備。它可以快速測量、存儲(chu) 和顯示懸浮在液體(ti) 中的分散細胞的一係列重要的生物物理和生化特征參數，並可以根據預選的參數範圍篩選出的細胞亞(ya) 群。大多數流式細胞儀(yi) 都是零分辨率儀(yi) 器，隻能測量細胞內(nei) 的總核酸、總蛋白等指標，而無法識別和測量特定部位的核酸或蛋白量。也就是說，它的細節分辨率為(wei) 零。

參數測量原理

流式細胞儀(yi) 可以同時進行多參數測量，信息主要來自特異性熒光信號和非熒光散射信號。測量是在測量區域內(nei) 進行的，所謂測量區域是照射的激光束與(yu) 從(cong) 孔口噴出的液流束的垂直交點。當液流中心的單個(ge) 細胞通過測量區域時，受到激光照射，以2π立體(ti) 角向整個(ge) 空間散射光。散射光的波長與(yu) 入射光的波長相同。散射光的強度及其空間分布與(yu) 細胞的大小、形狀、質膜和內(nei) 部結構密切相關(guan) ，因為(wei) 這些生物參數還與(yu) 細胞的光學特性有關(guan) ，例如光的反射和折射。未染色的細胞具有散射光的特征，因此可以使用不同的散射光信號對未染色的活細胞進行分析和分類。當然，由於(yu) 光學特性的變化，固定和染色的細胞與(yu) 活細胞具有不同的散射光信號。散射光不僅(jin) 與(yu) 作為(wei) 散射中心的細胞的參數有關(guan) ，還與(yu) 散射角、收集散射光的立體(ti) 角等非生物因素有關(guan) 。

在流式細胞術測量中，常用兩(liang) 種散射光散射方向：①前向角（即0角）散射（FSC）； ②側(ce) 向散射（SSC），又稱90角散射。此時所說的角度是指激光束的照射方向與(yu) 收集散射光信號的光電倍增管的軸向形成的大致角度。一般來說，前向角散射光的強度與(yu) 細胞的大小有關(guan) ，對於(yu) 相同的細胞群，前向角散射光的強度隨著細胞橫截麵積的增大而增大；對球形活細胞的實驗表明，在小立體(ti) 角範圍內(nei) 基本一致。截麵積的大小呈線性；對於(yu) 具有複雜形狀和方向的細胞，它們(men) 可能變化很大，並應特別注意。側(ce) 向散射光的測量主要用於(yu) 獲取有關(guan) 細胞內(nei) 部精細結構的顆粒性質的信息。側(ce) 向散射光雖然也與(yu) 細胞的形狀和大小有關(guan) ，但它對細胞膜、細胞質和核膜的折射率更敏感，對細胞質中較大的顆粒也能給出敏感的反應。並且還可以對細胞質中較大的顆粒做出靈敏的反應。並且還可以對細胞質中較大的顆粒做出靈敏的反應。

實際使用時，儀(yi) 器首先要測量光散射信號。當光散射分析與(yu) 熒光探針結合使用時，可以識別樣品中染色和未染色的細胞。光散射測量有效的用途是從(cong) 異質群體(ti) 中識別某些亞(ya) 群體(ti) 。

熒光信號主要包括兩(liang) 部分：①自發熒光，即細胞內(nei) 部的熒光分子受光照射後未經熒光染色而發出的熒光； ②特征熒光，即熒光染料發出的熒光染料被照射後與(yu) 細胞結合。熒光，其熒光強度較弱，且波長也與(yu) 照射的激光不同。自發熒光信號是噪聲信號，在大多數情況下會(hui) 幹擾特定熒光信號的分辨率和測量。在免疫細胞化學等測量中，如何提高信噪比是低結合水平熒光抗體(ti) 的關(guan) 鍵。一般來說，細胞成分中自發熒光分子（如核黃素、細胞色素等）含量越高，自發熒光越強；培養(yang) 細胞中死細胞/活細胞的比例越高，自發熒光越強；細胞樣品中亮細胞的比例越高，自發熒光越強。

減少自發熒光的幹擾，提高信噪比的主要措施有： 1、盡可能使用較亮的熒光染料； 2、選擇合適的激光器和濾光光學係統； 3. 使用電子補償(chang) 電路來補償(chang) 自發熒光的背景貢獻。