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酶聯免疫吸附測定（ELISA或ELASA）是指將可溶性抗原或抗體(ti) 與(yu) 聚苯乙烯等固相載體(ti) 結合，利用抗原抗體(ti) 特異性結合進行免疫反應的定性定量檢測方法。酶聯免疫吸附測定（ELISA）是免疫學中的經典實驗。
1971年，Engvall和Perlmann發表了用酶聯免疫吸附測定（ELISA）定量測定IgG的文章，使1966年開發的用於(yu) 抗原定位的酶標抗體(ti) 技術被用於(yu) 液體(ti) 中微量物質的檢測樣品。測試方法。
這種方法的基本原理是：
①將抗原或抗體(ti) 結合到某種固相載體(ti) 的表麵並保持其免疫活性。
②抗原或抗體(ti) 與(yu) 某種酶連接，形成酶標抗原或抗體(ti) ，既保留了其免疫活性，又保留了酶的活性。
測量時，待測樣品（其中的抗體(ti) 或抗原）和酶標抗原或抗體(ti) 按照不同的步驟與(yu) 固相載體(ti) 表麵的抗原或抗體(ti) 發生反應。固相載體(ti) 上形成的抗原抗體(ti) 複合物通過洗滌與(yu) 其他物質分離，與(yu) 固相載體(ti) 結合的酶量與(yu) 標本中被測物質的量成正比。加入酶反應的底物後，底物在酶的催化下變成有色產(chan) 物，該產(chan) 物的量與(yu) 樣品中被測物質的量直接相關(guan) ，因此可以根據其進行定性或定量分析。到顏色反應的深度。由於(yu) 酶的催化效率高，可以大大放大反應效果，使測定方法達到高靈敏度。
常用的ELISA可分為(wei) 以下五類：①直接ELISA； ②間接ELISA； ③夾心ELISA； ④競爭(zheng) 性ELISA； ⑤競爭(zheng) 性抑製ELISA。其他 ELISA 屬於(yu) 或源自這五種 ELISA 的組合。
其方法是將抗原按一定比例稀釋後包被於(yu) 固相載體(ti) 上，然後加入稀釋後的特異性酶標抗體(ti) ，孵育後加入底物顯色並判讀結果。直接ELISA的操作非常簡單，步驟也比較簡潔，但其應用範圍仍然很有限。一個(ge) 重要原因是這種ELISA隻經過一步信號放大（酶放大），因此其靈敏度不是很高；另外，其測定的對象也很有限，隻能測定酶標記的分子。
間接ELISA與(yu) 直接ELISA的區別在於(yu) ，間接ELISA中非酶標抗體(ti) 與(yu) 包被抗原結合，並引入了二抗（即二抗）。二抗是酶標的，可以與(yu) 一抗特異性結合，最後加入底物顯色並解讀結果。由於(yu) 二抗一般為(wei) 多克隆抗體(ti) ，一個(ge) 一抗分子可以結合多個(ge) 二抗分子，同時一個(ge) 二抗分子可以標記多個(ge) 酶分子，所以當待測抗體(ti) 為(wei) 多克隆抗體(ti) 時，信號經過兩(liang) 步放大，最終提高了檢測的靈敏度。此外，由於(yu) 二抗的製備相對容易，並且很早就開始商業(ye) 化，因此操作人員不需要進行一抗的酶標記，這大大減少了工作量。在檢測抗體(ti) 效價(jia) 、血清效價(jia) 以及篩選單克隆抗體(ti) 的過程中，間接ELISA是一個(ge) 非常重要的實驗過程。在臨(lin) 床診斷中，間接ELISA也是檢測標記抗體(ti) 的重要手段。間接ELISA也是檢測標記抗體(ti) 的重要手段。間接ELISA也是檢測標記抗體(ti) 的重要手段。
夾心ELISA一般可分為(wei) 直接夾心ELISA和間接夾心ELISA兩(liang) 種。
直接夾心ELISA分為(wei) 雙抗體(ti) 夾心ELISA和雙抗原夾心ELISA。
雙抗體(ti) 夾心ELISA的方法是將一抗（捕獲抗體(ti) ）包被於(yu) 固相載體(ti) 上，封閉後加入待檢測抗原，孵育後加入二抗（檢測抗體(ti) ）。捕獲抗體(ti) 和檢測抗體(ti) 可以是針對不同表位的兩(liang) 種單克隆抗體(ti) ，或者是針對相同抗原的一種單克隆抗體(ti) 和一種多克隆抗體(ti) ，但檢測抗體(ti) 需要用酶標記。
雙抗原夾心ELISA的原理和操作與(yu) 雙抗體(ti) 夾心ELISA基本相同。
對於(yu) 雙抗體(ti) 夾心ELISA，待測物必須包含兩(liang) 個(ge) 或多個(ge) 表位，否則檢測抗體(ti) 無法與(yu) 待測抗原結合。例如，雙抗體(ti) 夾心ELISA無法檢測半抗原和小分子抗原。對於(yu) 雙抗原夾心ELISA，操作與(yu) 間接ELISA基本相同，但使用特異性抗原代替酶標二抗，因此特異性比間接法更好。另外，由於(yu) 間接ELISA中使用的二抗一般隻識別IgG，而雙抗原夾心ELISA中可以檢測任何類似的免疫球蛋白，因此雙抗原夾心ELISA也比間接ELISA更靈敏。
間接夾心 ELISA 是基於(yu) 來自兩(liang) 個(ge) 不同物種的抗體(ti) 的夾心 ELISA。洗滌後，加入另一種種屬特異性抗體(ti) （非酶標，作為(wei) 檢測抗體(ti) ），最後加入酶標二抗（特異性識別檢測抗體(ti) ），然後加入底物顯色。與(yu) 直接雙抗夾心ELISA相比，間接夾心ELISA引入了特異性識別檢測抗體(ti) 的酶標二抗，相當於(yu) 對整個(ge) 係統的信號進行了一步放大係統，因此最終結果比直接雙抗體(ti) 夾心 ELISA 更靈敏。 。同時，由於(yu) 間接夾心ELISA中酶標二抗隻能識別檢測抗體(ti) ，而不是捕獲抗體(ti) ，係統的特異性也得到了保證。
該方法首先將特異性抗體(ti) 吸附在固相載體(ti) 表麵，洗滌後分為(wei) 兩(liang) 組：一組加入酶標抗原與(yu) 待測抗原的混合物；一組加入酶標抗原與(yu) 待測抗原的混合物。另一組隻加入酶標抗原，孵育、洗滌後加入底物顯色，兩(liang) 組底物降解量之差即為(wei) 待測定的未知抗原量。用這種方法測定的抗原隻需具有一個(ge) 結合位點。因此，該方法常用於(yu) 激素、藥物等小分子抗原的測定。
將抗原預包被於(yu) 固相載體(ti) 上，實驗時加入稀釋後的待檢測抗原（或抗體(ti) ），然後依次加入該抗體(ti) 對應的特異性抗體(ti) 和酶標二抗。待測樣品中的抗原（或抗體(ti) ）與(yu) 預製備係統中固相載體(ti) 上結合的抗原（或抗體(ti) ）競爭(zheng) 與(yu) 特定抗體(ti) （或固相載體(ti) 上結合的抗原）的結合。洗掉競爭(zheng) 性特異性抗體(ti) ，最後添加底物顯色。最終的顏色結果與(yu) 待檢測的抗原（或抗體(ti) ）的量成反比。
無論哪種ELISA，其操作均由以下基本操作組成：①將抗原或抗體(ti) 吸附到固相載體(ti) 上； ②添加待測樣品及後續試劑； ③孵化； ④洗滌並除去遊離的未結合反應物； ⑤ 添加酶檢測底物； ⑥ 結果解釋。
夾心法常用於(yu) 檢測大分子抗原。一般操作步驟為(wei) ：
將特異性抗體(ti) 固定（包被）在塑料孔板上，完成後洗掉多餘(yu) 的抗體(ti) ；
添加待測樣品。如果樣品中含有待測抗原，它會(hui) 與(yu) 塑料孔板上的抗體(ti) 特異性結合；
洗掉多餘(yu) 的待測樣品，加入另一種對該抗原特異的一抗，與(yu) 待測抗原結合；
洗掉多餘(yu) 未結合的一抗，加入酶聯二抗，與(yu) 一抗結合；
洗掉多餘(yu) 的未結合二抗，加入酶底物使酶顯色，用肉眼或儀(yi) 器讀取顯色結果。
間接方法常用於(yu) 檢測抗體(ti) 。一般操作步驟為(wei) ：
將已知抗原固定在塑料孔板上，完成後洗去多餘(yu) 的抗原；
添加待測樣品。如果樣品中含有待測一抗，它會(hui) 與(yu) 塑料孔板上的抗原特異性結合；
洗去多餘(yu) 的待測樣品，加入帶酶的二抗，與(yu) 待測一抗結合；
洗去多餘(yu) 未結合的二抗，加入酶底物使酶顯色，用儀(yi) 器（ELISA讀數器）測定塑料板中的吸光度值（OD值），評價(jia) 顯色終產(chan) 物的含量，從(cong) 而測定抗體(ti) 被測試內(nei) 容。
競爭(zheng) 法是一種不太常用的ELISA檢測機製，一般用於(yu) 檢測小分子抗原。操作步驟如下：
將特異性抗體(ti) 固定在塑料孔板上，完成後洗掉多餘(yu) 的抗體(ti) ；
添加待測樣品，使樣品中的待測抗原與(yu) 塑料孔板上的抗體(ti) 特異性結合；
添加帶有酶的抗原，該抗原也可以與(yu) 塑料孔板上的抗體(ti) 特異性結合。由於(yu) 固定在塑料孔板上的抗體(ti) 數量有限，當標本中的抗原量較多時，帶有酶的抗原能結合的固定抗體(ti) 就較少，即兩(liang) 種抗原都競爭(zheng) 結合塑料孔板上的抗體(ti) ，這就是所謂競爭(zheng) 法的由來；
用酶洗去樣品和抗原，加入酶底物使酶顯色。當樣品中抗原的量越多時，說明塑料孔板中殘留的帶酶的抗原越少，顏色就越深。淺的。
當需要檢測無法獲得兩(liang) 種以上抗體(ti) 的抗原，或者難以獲得足夠的純化抗體(ti) 固定在孔板上時，一般會(hui) 考慮使用競爭(zheng) ELISA。
親(qin) 和素是一種糖蛋白，一分子親(qin) 和素可與(yu) 四個(ge) 生物素小分子產(chan) 生特異的親(qin) 和力，類似於(yu) 抗原和抗體(ti) 的親(qin) 和力。它們(men) 之間的作用力是已知比較好的非共價(jia) 相互作用。 20世紀80年代後，隨著生物素-親(qin) 和素係統（BAS）的發現，這種親(qin) 和力被應用到ELISA技術中，大大提高了後者反應的靈敏度和特異性。生物素很容易與(yu) 蛋白質（如抗體(ti) 等）共價(jia) 結合。這樣，與(yu) 酶結合的親(qin) 和素分子與(yu) 與(yu) 特異性抗體(ti) 結合的生物素分子發生反應，不僅(jin) 起到多級放大作用，而且遇到相應的酶時，會(hui) 因酶的催化作用而變色。底物，實現檢測。未知抗原（或抗體(ti) ）分子的用途。
定性判定的結果是對待測樣品中是否含有待測抗原或抗體(ti) 給出“是"或“否"的簡單回答，分別表示為(wei) “陽性"和“陰性"。 “陽性"表示樣本在檢測係統中出現反應。 “否定"意味著沒有反應。通過定性判斷方法也可以獲得半定量結果，即用滴度來表示反應的強度，其本質仍然是定性檢測。在這種半定量測定中，樣品經過一係列稀釋後進行測試，產(chan) 生陽性反應的最高稀釋度即為(wei) 效價(jia) 。根據滴度可以判斷樣品的反應活性，這比通過觀察未稀釋樣品的顏色深淺來判斷強陽性和弱陽性更具定量意義(yi) 。
在間接和夾心 ELISA 中，陽性孔比陰性孔更暗。相反，在競爭(zheng) 性 ELISA 中，陰性孔比陽性孔更暗。
ELISA操作步驟複雜，影響反應的因素較多。特別是固相載體(ti) 的包被很難達到個(ge) 體(ti) 間的一致性。因此，在定量測定時，每批測試必須使用一係列不同濃度的參考標準。在此條件下製作標準曲線。夾心ELISA用於(yu) 測定大分子量物質，標準曲線的範圍一般較寬，曲線最高點吸光度可接近2.0。常采用半對數值作圖，以供試品濃度為(wei) 橫坐標，吸光度為(wei) 縱坐標。將濃度值逐點連接，得到的曲線一般呈S形，頭部和尾部曲線趨於(yu) 平坦，中部較為(wei) 平直的部分是好的檢測區域。
小分子量物質的測定常用競爭(zheng) 法，標準曲線中的吸光度與(yu) 被測物質的濃度呈負相關(guan) 。標準曲線的形狀根據試劑盒中使用的模式略有不同。注意ELISA測定標準曲線中橫坐標為(wei) 對數關(guan) 係，更有利於(yu) 測定體(ti) 係的表達。
(1)底物成分漏加、底物失效、底物配製濃度計算錯誤；
（2）整個(ge) ELISA過程中存在抗原或抗體(ti) 不匹配的情況；
(3)整個(ge) ELISA過程中樣品過度稀釋；
(4)稀釋係統錯誤，如使用含蛋白質的試劑進行包被。
(1)酶標抗原或抗體(ti) 濃度過高，嚐試降低濃度；
(2)使用的封閉試劑不正確或未封閉；
（3）酶標抗原或抗體(ti) 與(yu) 係統中其他試劑結合；
(4)底物被酶標抗原或抗體(ti) 汙染。
(1)如果ELISA板存在質量問題，重新檢查ELISA板的同質性；
(2)在塗覆或加樣過程中，某些孔漏氣或加得少，可能是操作者不小心，或移液器漏氣；
(3)加樣時移液器內(nei) 注入過多氣泡；
（4）購買(mai) 的ELISA板不正確，可能誤選其他用途的板；
(5)培養(yang) 過程中平板疊放過厚；
（6）樣品添加或稀釋過程中試劑混合不充分，或稀釋梯度計算錯誤；
(7)洗板不當，有的孔未充滿洗液或加洗滌劑後洗液未充分混合，或洗板過程中帶入氣泡。
(1)酶標抗原或抗體(ti) 濃度過高；
(2)某種試劑濃度過高。
(1)酶標抗原或抗體(ti) 濃度過低，或標記效率低，或標記後影響免疫活性；
(2)試劑被汙染，如HRP酶標抗原或抗體(ti) 被疊氮hua鈉汙染；
(3)反應溫度太低；
(4)底物緩衝(chong) 液的pH值不正確。
(1)酶標抗原或抗體(ti) 濃度過高；
(2) 抗體(ti) 的非特異性結合；
（3）抗原、抗體(ti) 不純；
(4)二抗的物種交叉識別。
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