什麽是實時定量 PCR？

實時定量 PCR 是一種使用熒光化學物質測量 DNA 擴增反應中每個(ge) 聚合酶鏈式反應 (PCR) 循環後產(chan) 物總量的方法。通過內(nei) 參或外參方法對待測樣品中特定DNA序列進行定量分析的方法。

實時PCR是在PCR擴增過程中通過熒光信號實時檢測PCR過程。由於(yu) 在PCR擴增的指數期內(nei) ，模板的Ct值與(yu) 模板的初始拷貝數之間存在線性關(guan) 係，因此成為(wei) 定量的依據。

PCR技術原理

所謂實時定量PCR技術是指在PCR反應體(ti) 係中添加熒光基團，利用熒光信號的積累實時監測整個(ge) PCR過程，最後通過標準品對未知模板進行定量分析的方法。曲線。

檢測方法

1. SYBR Green I 方法：

PCR反應體(ti) 係中加入過量的SYBR熒光染料。 SYBR熒光染料特異性摻入DNA雙鏈後，發出熒光信號，而未摻入鏈中的SYBR染料分子不會(hui) 發出任何熒光信號，從(cong) 而保證了熒光信號的增加全同步隨著PCR產(chan) 物的增加。

2.TaqMan探針法：

當探針完整時，報告基團發出的熒光信號被猝滅基團吸收；在 PCR 擴增過程中，Taq 酶的 5'-3' 核酸外切酶活性裂解並降解探針，形成報告熒光團和猝滅基團。將熒光基團分開，使熒光監測係統能夠接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就形成一個(ge) 熒光分子，熒光信號的積累與(yu) DNA鏈的形成全同步。 PCR 產(chan) 物。

技術原理

熒光素標記的Taqman探針與(yu) 模板DNA混合後，完成高溫變性、低溫複性、適宜溫度延伸的熱循環，根據模板DNA互補的Taqman探針被切斷聚合酶鏈反應定律。熒光素在反應體(ti) 係中呈遊離態，在特定光激發下發出熒光。隨著循環次數的增加，擴增的目的基因片段呈指數增長。通過實時檢測隨擴增變化而變化的相應熒光信號強度，獲得Ct值，同時以已知模板濃度的幾種標準品作為(wei) 對照，計算樣品中目的基因的拷貝數可以得到待測試的。

CT值

Ct值（Cycle Threshold，循環閾值）的含義(yi) 是：每個(ge) 反應管內(nei) 熒光信號達到設定閾值時所經曆的循環次數

1. 熒光閾值（threshold）設置

PCR反應的前15個(ge) 循環的熒光信號作為(wei) 熒光背景信號，熒光閾值默認（default）設置為(wei) 第3-15個(ge) 循環的熒光信號標準差的10倍，即：閾值 = 10*SDcycle 3- 15

2. Ct值與起始模板的關係

每個(ge) 模板的Ct值與(yu) 模板初始拷貝數的對數呈線性關(guan) 係，公式如下。
Ct=-1/lg(1+Ex)*lgX0+lgN/lg(1+Ex) 初始拷貝數越高，Ct 值越低。使用已知初始拷貝數的標準品可以製作標準曲線，其中橫坐標表示初始拷貝數的對數，縱坐標表示Ct值。因此，隻要獲得未知樣品的Ct值，就可以從(cong) 標準曲線計算出該樣品的起始拷貝數。
n為(wei) 擴增反應的循環數，X0為(wei) 初始模板量，Ex為(wei) 擴增效率，N為(wei) 當熒光擴增信號達到閾值強度時擴增產(chan) 物的量。

熒光化學品

實時定量PCR中使用的熒光物質可分為(wei) 熒光探針和熒光染料兩(liang) 類。原理簡述如下：
1. TaqMan熒光探針：在PCR擴增過程中，隨一對引物一起添加特異性熒光探針。探針是寡核苷酸，兩(liang) 端都標記有報告熒光基團和猝滅劑。熒光團。當探針完整時，報告基團發出的熒光信號被猝滅基團吸收；在 PCR 擴增過程中，Taq 酶的 5'-3' 核酸外切酶活性裂解並降解探針，形成報告熒光團和猝滅基團。熒光基團分離，使熒光監測係統能夠接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈就形成一個(ge) 熒光分子，熒光信號的積累與(yu) PCR的形成全同步產(chan) 品。新型TaqMan-MGB探針使該技術能夠同時進行定量基因分析和基因突變（SNP）分析，有望成為(wei) 基因診斷和個(ge) 性化醫療分析的技術平台。

2. SYBR熒光染料：在PCR反應體(ti) 係中，加入過量的SYBR熒光染料，SYBR熒光染料非特異性摻入DNA雙鏈，並發出熒光信號，而未摻入DNA雙鏈的SYBR染料分子則發出熒光信號。鏈不會(hui) 發射任何熒光。信號，從(cong) 而保證熒光信號的增加與(yu) PCR產(chan) 物的增加全同步。 SYBR 僅(jin) 與(yu) 雙鏈 DNA 結合，因此熔解曲線可用於(yu) 確定 PCR 反應是否具有特異性。

3、分子信標：是一種莖環雙標記寡核苷酸探針，在5、3端形成約8個(ge) 堿基的發夾結構。兩(liang) 端的核酸序列互補配對，導致熒光團和猝滅基團非常接近並且不發出熒光。 PCR產(chan) 物生成後，在退火過程中，分子信標的中間部分與(yu) 特定的DNA序列配對，熒光基因和猝滅基因分離，產(chan) 生熒光[1]。

傳統定量PCR

1. 傳統定量PCR方法介紹

1）內(nei) 參法：將定量的內(nei) 標和引物加入到不同的PCR反應管中，通過基因工程方法合成內(nei) 標。上遊引物有熒光標記，下遊引物沒有熒光標記。在擴增模板的同時，內(nei) 標也被擴增。 PCR產(chan) 物中，由於(yu) 內(nei) 標和目標模板的長度不同，可以通過電泳或高效液相分離兩(liang) 者的擴增產(chan) 物，並分別測定它們(men) 的熒光強度，內(nei) 標可以用作定量待檢測模板的對照。
2）競爭(zheng) 法：選擇含有突變克隆產(chan) 生的新內(nei) 切酶位點的外源競爭(zheng) 模板。在同一反應管中，用同一對引物（其中一個(ge) 引物帶有熒光標記）同時擴增待測樣品和競爭(zheng) 模板。擴增後，PCR產(chan) 物用核酸內(nei) 切酶消化，競爭(zheng) 模板的產(chan) 物被消化成兩(liang) 個(ge) 片段，而待測模板則不被酶切。可以通過電泳或高效液相分離兩(liang) 種產(chan) 物，並可以單獨測量熒光強度，根據已知模板推斷未知模板的初始拷貝數。
3）PCR-ELISA法：利用di高辛或生物素等標記引物，將擴增產(chan) 物與(yu) 固相板上的特異性探針結合，然後加入抗di高辛或生物素酶標抗體(ti) -辣根過氧化反應。底物酶結合，最後酶使底物顯色。常規的PCR-ELISA方法隻是定性實驗。若加入內(nei) 標物製作標準曲線，也可達到定量檢測的目的。

2. 內標在傳統定量中的作用

由於(yu) 傳(chuan) 統的定量方法是終點檢測，即PCR到達平台期後進行檢測，而當PCR通過對數期擴增到達平台期時，檢測重現性極差。同一個(ge) 模板在96孔PCR機上重複96次，得到的結果相差很大，因此無法直接從(cong) 終產(chan) 物的量計算出起始模板的量。通過添加內(nei) 標可以部分消除最終產(chan) 品定量造成的誤差。但即便如此，傳(chuan) 統的定量方法也隻能算是半定量和粗略的定量方法。

3.內標對定量PCR的影響

如果在待測樣品中加入初始拷貝數已知的內(nei) 標，則PCR反應變成雙PCR，雙PCR反應中兩(liang) 個(ge) 模板之間存在幹擾和競爭(zheng) ，特別是當內(nei) 標的初始拷貝數為(wei) 已知的內(nei) 標時。兩(liang) 個(ge) 模板差異比較大的時候，這種競爭(zheng) 就會(hui) 更加顯著。但由於(yu) 待測樣品的初始拷貝數未知，因此無法添加適量的已知模板作為(wei) 內(nei) 標。也正是因為(wei) 這個(ge) 原因，傳(chuan) 統的定量方法雖然增加了內(nei) 標，但仍然隻是一種半定量方法。

實時定量PCR

實時熒光定量PCR技術有效解決(jue) 了傳(chuan) 統定量僅(jin) 終點檢測的局限性，實現每個(ge) 循環檢測一次熒光信號強度，並記錄在計算機軟件中，通過計算Ct值對每個(ge) 樣品，根據標準曲線獲得定量結果。因此，無內(nei) 標實時定量PCR基於(yu) 兩(liang) 個(ge) 基礎：
1）Ct值的重現性 當PCR循環達到Ct值所在的循環數時，剛剛進入真正的指數擴增階段（對數階段）。此時，微小的誤差還沒有被放大，因此Ct值的重現性好。 ，即同一個(ge) 模板在不同時間擴增或者在不同管中同時擴增，得到的Ct值是恒定的。
2）Ct值與(yu) 起始模板的線性關(guan) 係 由於(yu) Ct值與(yu) 起始模板的對數之間存在線性關(guan) 係，因此可以利用標準曲線來定量測定未知樣品。因此，實時熒光定量PCR是一種利用外標曲線的定量方法。方法。
與(yu) 內(nei) 標法相比，外標曲線定量法是一種準確、可靠的科學方法。使用外標曲線的實時熒光定量PCR是迄今為(wei) 止最準確、重現性好的定量方法。已得到世界的認可，廣泛應用於(yu) 基因表達研究、轉基因研究、藥效評估、病原檢測等領域。

實時熒光定量PCR的定量方法

在實時PCR中，模板定量有兩(liang) 種策略：相對定量和絕對定量。

實時熒光定量PCR相關應用

臨床疾病診斷

各類肝炎、艾滋病、流感、肺結核、性病等傳(chuan) 染病的診斷及療效評價(jia) ；地中海貧血、血友病、性別發育不良、智力低下綜合征、胎兒(er) 畸形的優(you) 生學和產(chan) 前檢查；腫瘤標誌物和腫瘤基因檢測實現腫瘤疾病的診斷；基因檢測實現了遺傳(chuan) 病的診斷。

動物疫病檢測

流感、新城疫、口蹄疫、豬瘟、沙門氏菌、大腸杆菌、胸膜肺炎放線杆菌、寄生蟲病等、炭疽杆菌。

食品安全

乳製品企業(ye) 中食品源性微生物、食品過敏原、轉基因生物、阪崎腸杆菌的檢測。

科學研究

與(yu) 醫學、農(nong) 牧業(ye) 、生物學相關(guan) 的分子生物學定量研究。

應用行業

各級各類醫療機構、大專(zhuan) 院校及科研院所、疾控中心、檢驗檢疫局、獸(shou) 醫站、食品企業(ye) 及乳品廠等。由於(yu) qPCR是病原基因核酸的實時定量檢測，因此
具有更多的特性。與(yu) 化學發光、時間分辨率、蛋白芯片等免疫學方法相比具有優(you) 勢。