PI單染法實驗原理及步驟

PI單染的原理主要是根據細胞凋亡過程中細胞、亞(ya) 細胞和分子水平發生的特征性變化。這些變化包括細胞核的變化、細胞器的變化、細胞膜成分的變化和細胞形態的變化，其中細胞核的變化很有特征。

PI簡介

熒光染料PI（碘化丙啶）是一種可以對DNA進行染色的核染色試劑。它常用於(yu) 細胞凋亡檢測。英文全稱是Propidium Iodide。它是一種溴化乙錠類似物，嵌入雙鏈 DNA 後會(hui) 發出紅色熒光。雖然 PI 不能穿過活細胞膜，但它可以穿過受損的細胞膜並對細胞核進行染色。 PI 通常與(yu) Calcein-AM 或 FDA 等熒光探針一起使用，以同時對活細胞和死細胞進行染色。 PI-DNA複合物的激發波長和發射波長分別為(wei) 535 nm和615 nm。

外觀：紅棕色粉末儲(chu) 存條件：-20℃

PI單染法實驗原理

1、細胞核的變化：由於(yu) 凋亡細胞細胞核的變化，導致各種染色體(ti) 熒光染料對凋亡細胞DNA的染色性發生改變。研究表明，用各種染色體(ti) 熒光染料對固定的凋亡細胞進行染色會(hui) 降低 DNA 染色能力。許多學者將 DNA 染色性的降低視為(wei) 凋亡細胞的標誌之一。

2.光散射特性：凋亡細胞形態的變化影響其光散射特性。在流式細胞儀(yi) 上，前向散射光與(yu) 細胞的大小有關(guan) ，而側(ce) 向散射光反映了細胞內(nei) 光的折射，與(yu) 細胞內(nei) 顆粒的數量有關(guan) 。細胞凋亡時，細胞收縮，體(ti) 積變小，因此前向散射光減少。這一特征通常被認為(wei) 是凋亡細胞的特征之一。另外，由於(yu) 細胞凋亡時染色體(ti) 的降解和核破裂的形成，細胞內(nei) 顆粒常增多，故凋亡細胞的側(ce) 向散射光常增多。細胞壞死時，由於(yu) 細胞腫脹，前向散射光增加；細胞壞死時側(ce) 向散射光也增加，因此根據前向散射光和側(ce) 向散射光可以區分凋亡細胞和壞死細胞。但需要注意的是，根據前向散射光和側(ce) 向散射光判斷凋亡細胞的可靠性，很大程度上受檢測細胞形態的均勻性和核質比的影響。因此，在某些淋巴細胞凋亡中，通過光散射特性檢測細胞凋亡的可靠性較好，但在腫瘤細胞凋亡中，其可靠性較差。基於(yu) 光散射特性檢測凋亡細胞的主要優(you) 點是，光散射特性可以與(yu) 細胞的表麵免疫熒光分析相結合，以區分經過這些特殊處理後發生選擇性凋亡的淋巴細胞亞(ya) 型。它還可用於(yu) 活細胞的分類。

PI 單染試劑和儀器

1、PBS溶液；
2、PI染色液：將PI溶解於(yu) PBS(pH7.4)中，終濃度為(wei) 100ug/ml。儲(chu) 存在棕色瓶中，4°C 避光保存。
3,70%乙醇4,400目篩5，流式細胞儀(yi)

PI單染實驗步驟

1.收集細胞，500~1000r/min離心5min，棄去培養(yang) 基。
2.用3ml PBS洗滌一次。
3. 離心除去PBS，加入冰冷的70%乙醇固定，4℃固定1-2小時。
4. 離心棄固定液，重懸於(yu) 3ml PBS 中 5 分鍾。
5. 過400目篩一次，500-1000 r/min離心5 min，棄PBS。
6. 用1ml PI染色液染色，4℃避光30min。
7、流式細胞儀(yi) 檢測：PI被氬離子激發產(chan) 生熒光，激光光波波長為(wei) 488nm，發射光波波長大於(yu) 630nm，產(chan) 生紅色熒光，分析熒光直方圖PI的強度，並分析前向散射光到側(ce) 向散射光的散射。圖片。
8.結果判斷：在前向散射光與(yu) 側(ce) 向散射光的散點圖或地形圖上，與(yu) 正常細胞相比，凋亡細胞的前向散射光較低，而側(ce) 向散射光可高可低，這與(yu) 正常細胞相比，凋亡細胞的前向散射光較低，而側(ce) 向散射光可高可低。細胞類型；在分析PI熒光直方圖時，首先使用門技術排除雙或聚集的細胞以及發出微弱熒光的細胞碎片。在PI熒光直方圖上，凋亡細胞在G1/G0期倍性峰之前出現一二二。例如，如果G1/G0期位置的熒光強度為(wei) 1.0，則典型凋亡細胞樣品的亞(ya) 二倍體(ti) 峰的熒光強度為(wei) 0.45，則可以使用雞和鮭魚紅細胞的PI熒光強度作為(wei) 參考標準。 0.35 和 0.7，分別確保其間不是細胞碎片而是完整的細胞。

注：在細胞凋亡過程中，DNA 染色性的降低被認為(wei) 是凋亡細胞的標誌之一，但這種 DNA 染色性的降低也可能是由於(yu) DNA 含量的減少，或由於(yu) DNA 結構的變化所致。這是由於(yu) 其與(yu) 染料結合的能力發生變化引起的。分析結果時應小心。