流式細胞術應用熒光染料簡介

熒光是指光致發光現象。當某種室溫物質受到一定波長的入射光照射時，分子中的電子吸收光能後達到高能級，進入激發態，並立即去激發並恢複到原來的狀態，而多餘(yu) 的能量則以光的形式輻射出去，即發出比入射光波長更長的光（通常在可見光波段）。一旦停止入射光，發光現象立即消失。也就是說，當物體(ti) 吸收短波光的能量時，它可以發射比原來吸收的波長更長的光。具有這種性質的物質或分子稱為(wei) 熒光素或熒光染料。

當激光束與(yu) 細胞正交時，通常會(hui) 產(chan) 生兩(liang) 個(ge) 熒光信號。一是細胞本身在激光照射下發出微弱的熒光信號，稱為(wei) 細胞自發熒光；定量分析可以深入了解所研究的細胞參數的存在和定量。

(1) 熒光信號的意義

熒光信號可以反映不同細胞的生物學特性。例如，熒光染料標記的單克隆抗體(ti) 與(yu) 細胞表麵的抗原、受體(ti) 或膜糖蛋白特異性結合，在激光的激發下發出一定波長的熒光。熒光信號的強度反映了膜抗原、受體(ti) 或糖蛋白的相對數量。通過收集和分析熒光信號，可以實現細胞亞(ya) 群和功能的分析。 DNA用DNA染料染色，染料以一定的方式與(yu) DNA鏈結合。在激光的激發下，染料發出熒光，通過測量熒光的強度，可以獲得相對DNA含量，進而確定細胞周期階段。分析。使用特定的熒光染料還可用於(yu) 測量細胞鈣離子濃度、細胞內(nei) pH值和細胞膜電位。

(2)熒光染料的選擇

可以使用的熒光染料有很多種，由於(yu) 它們(men) 的分子結構不同，它們(men) 的熒光激發和發射光譜也不同。選擇染料或單克隆抗體(ti) 標記的熒光素時，必須考慮儀(yi) 器配置的激光光源的波長，即染料的激發光譜；儀(yi) 器激光器的激發光波長盡可能接近熒光染料的激發光譜峰；另外，熒光染料還必須考慮染料的發射顏色，即染料的發射光譜，需要選擇合適波段的檢測器來檢測相應的熒光信號。

由於(yu) 目前的流式細胞儀(yi) 配備有多個(ge) 熒光信號檢測器，當儀(yi) 器同時檢測多個(ge) 熒光時，每個(ge) 熒光檢測器隻允許一定波長的熒光信號進入並被檢測，因此用戶必須選擇合適的熒光信號接收器才能接收好的信號。還需要注意的是，使用激光波長相同的熒光染料，其發射波長不同，這樣才能被相應波段的檢測器接收到，達到同時檢測的目的。

檢測器的選擇基於(yu) 了解熒光染料的發射光譜。以三色FCM為(wei) 例，如果熒光光譜峰落在綠色範圍內(nei) （波長515-545nm），則選擇第一個(ge) 熒光檢測器；如果光譜值落在橙紅色範圍內(nei) (564-606nm)，則選擇第二熒光檢測器；如果熒光光譜值落在深紅色範圍內(nei) （波長650 nm），則選擇第三個(ge) 熒光檢測器。目前桌麵FCM常用的激光為(wei) 488nm，常用的染料有PI、PE、FITC、PERCP、CY5、APDye Fluors等。

(3) 熒光標記抗體組合

在使用流式細胞術進行多色分析時，如果想要得到理想的分析結果，需要選擇抗體(ti) 的熒光匹配。經常考慮的因素如下。

1 熒光素的熒光強度

特定抗體(ti) 區分陰性和陽性結果的能力取決(jue) 於(yu) 該抗體(ti) 標記的熒光素。每種熒光素具有不同的光子釋放能力和不同的相對熒光強度。一般用染色指數來比較不同熒光標記的光信號強度。染色指數是陽性信號與(yu) 陰性信號之差與(yu) 陰性峰分布寬度的比值，用於(yu) 判斷熒光染料區分弱陽性表達的能力。同一個(ge) 單克隆抗體(ti) 用8種不同的熒光素標記，得到不同的染色結果。我們(men) 需要找到一種具有更高染色指數的熒光染料來標記微弱的信號。

可以看出，對於(yu) 特定的單克隆抗體(ti) ，由於(yu) 使用不同的熒光素標記，陰性核陽性細胞的S/N比（信噪比）可相差4-6倍。一般來說，熒光信號由強到弱的順序為(wei) ：PE>APC>PE-CY5>PERCP-CY5.5>FITC>PERCP。

選擇熒光標記抗體(ti) 時，需要考慮以下因素：

熒光素標記效率：抗體(ti) 上標記的熒光素量（F/P）值也會(hui) 影響相對熒光強度。每個(ge) 抗體(ti) 可以標記多個(ge) FITC 或 PERCP 分子（通常為(wei) 2-9 個(ge) ），而 APC 和 PE 標記的量約為(wei) 每個(ge) 抗體(ti) 一個(ge) 熒光分子。 FITC是小分子化合物，而PE、PERCP和APC是分子量較大的熒光蛋白。受熒光標記化學性質的限製，IGM型抗體(ti) 通常僅(jin) 標記小分子熒光素，如FITC、TEXAS RED、CY3和CY5等。

抗體(ti) 檢測的抗原密度：高表達的抗原幾乎可以用任何熒光素標記的抗體(ti) 來檢測，而低表達的抗體(ti) 則需要用信噪比較高的熒光素標記的抗體(ti) 來檢測，從(cong) 而有效區分陽性細胞群和陰性細胞目的。

細胞自發熒光：每個(ge) 細胞群的自發熒光水平各不相同，盡管可以觀察到高熒光強度的細胞，但在高波長範圍（>600nm）中自發熒光迅速下降。當檢測具有高水平自發熒光的細胞時，使用具有較長發射波長的熒光染料（例如 APC）可以獲得更好的信噪比。如果是自發熒光水平較低的細胞，那麽(me) 使用較長波長的激發光對於(yu) 改善正負差異的現象影響不大。可以使用 FITC 標記的抗體(ti) 。

2 非特異性結合

一些熒光標記抗體(ti) 表現出低水平的非特異性結合，導致陰性細胞中的熒光水平增加。這種非特異性結合通常由兩(liang) 個(ge) 因素引起：

單克隆抗體(ti) 的同型對照：一些 IGG 型同型對照對某些細胞類型的 FC 受體(ti) 結合更敏感

使用熒光素：有時 CY3、CY5、CY5.5 和德克薩斯紅直接標記的抗體(ti) 以及一些串聯偶聯抗體(ti) 可增強與(yu) 某些細胞亞(ya) 群的結合。對於(yu) CY5，研究表明，這主要是由於(yu) 染料與(yu) 低親(qin) 和力FC受體(ti) 的相互作用較弱； PE-CY5標記的抗體(ti) 也有類似的效果。另外，在某些情況下（例如用抗HLA-DG PE/抗單核細胞PerCP-CY5.5分析單核細胞），該功能也可用於(yu) 有意增加標記抗體(ti) 中CY染料的標記量，這確保了無論每個(ge) 單核細胞的 CD14 表達水平有何差異，都可以檢測到單核細胞。

總之，在通過流式細胞術進行多色分析時，應仔細選擇熒光抗體(ti) 標記的熒光染料。主要影響因素有：根據不同型號選擇合適的熒光抗體(ti) （激光功率和波長）；染色細胞抗原表達的相對密度（表達密度低的抗原應選擇較亮的熒光染料）； FC 對陰性細胞受體(ti) 狀態。另外，在進行多色分析時，需要盡可能選擇熒光波之間光譜重疊較少的熒光染料進行組合，同時需要進行正確的調整和補償(chang) 。

3. 熒光補償的調整

當細胞攜帶兩(liang) 種或多種熒光素（如PE和FITC）並被激光激發發射兩(liang) 種以上不同波長的熒光時，理論上可以選擇濾光片使得每種熒光隻能被相應的檢測器檢測到，而將不會(hui) 檢測到其他熒光。然而，由於(yu) 目前使用的各種熒光染料具有較寬的發射光譜特性，雖然各自的發射峰不同，但發射光譜範圍有一定程度的重疊，因此少量不需要檢測的另一種熒光信號也會(hui) 被檢測到。被檢測到。是通過這個(ge) 光電倍增管來檢測的，所以每個(ge) 光電倍增管實際上檢測的是兩(liang) 種熒光的總和，隻不過每種熒光都以某一種熒光為(wei) 主。熒光素的發射光譜有一定的範圍，其發射信號的極小部分必然會(hui) 進入另一次檢測。 FITC 檢測器將檢測少量的 PE 光譜，而 PE 光譜檢測器將檢測更多的 FITC 光譜。

由於(yu) 光譜重疊占檢測信號的一定比例，因此熒光補償(chang) 的方法是從(cong) 接收到的熒光信號中減去另一檢測器中接收到的信號（即光譜重疊）的一部分，從(cong) 而使另一檢測器信號 該檢測器檢測到的信號與(yu) 負背景信號一致，因此光電倍增管中輸出的信號實際上僅(jin) 代表一定檢測的信號，而不受其他波長的熒光信號的幹擾。利用標準的已知單陽性樣本，可以合理設定熒光信號的補償(chang) 值。補償(chang) 程度可以通過同時測量雙熒光參數的儀(yi) 器條件來確定。補償(chang) 時，首先測量染料的熒光 (FL1)。此時，除了應接收熒光的光電倍增管如FL1檢測器有信號輸出外，其他光電倍增管FL2檢測器也常常出現微弱的輸出。調整補償(chang) 然後調整補償(chang) 器FL2-%1FL1，使FL2檢測器輸出的平均熒光強度與(yu) 負信號一致；然後測量另一種染料（FL2），然後調節補償(chang) 器FL1-%FL2，使FL1檢測器輸出的平均熒光強度與(yu) 負信號匹配。負麵信號是一致的。如此反複調整，FL1和FL2探測器即可得到充分補償(chang) 。除了應接收熒光的光電倍增管如FL1檢測器的信號輸出外，其他光電倍增管FL2檢測器也常常輸出微弱。調整補償(chang) 然後調整補償(chang) 器FL2-%1FL1，使FL2檢測器輸出的平均熒光強度與(yu) 負信號一致；然後測量另一種染料（FL2），然後調節補償(chang) 器FL1-%FL2，使FL1檢測器輸出的平均熒光強度與(yu) 負信號匹配。負麵信號是一致的。如此反複調整，FL1和FL2探測器即可得到充分補償(chang) 。除了應接收熒光的光電倍增管如FL1檢測器的信號輸出外，其他光電倍增管FL2檢測器也常常輸出微弱。調整補償(chang) 然後調整補償(chang) 器FL2-%1FL1，使FL2檢測器輸出的平均熒光強度與(yu) 負信號一致；然後測量另一種染料（FL2），然後調節補償(chang) 器FL1-%FL2，使FL1檢測器輸出的平均熒光強度與(yu) 負信號匹配。負麵信號是一致的。如此反複調整，FL1和FL2探測器即可得到充分補償(chang) 。調整補償(chang) 然後調整補償(chang) 器FL2-%1FL1，使FL2檢測器輸出的平均熒光強度與(yu) 負信號一致；然後測量另一種染料（FL2），然後調節補償(chang) 器FL1-%FL2，使FL1檢測器輸出的平均熒光強度與(yu) 負信號匹配。負麵信號是一致的。如此反複調整，FL1和FL2探測器即可得到充分補償(chang) 。調整補償(chang) 然後調整補償(chang) 器FL2-%1FL1，使FL2檢測器輸出的平均熒光強度與(yu) 負信號一致；然後測量另一種染料（FL2），然後調節補償(chang) 器FL1-%FL2，使FL1檢測器輸出的平均熒光強度與(yu) 負信號匹配。負麵信號是一致的。如此反複調整，FL1和FL2探測器即可得到充分補償(chang) 。

進行多色分析時，必須使用每個(ge) 熒光素單陽性樣品進行檢測，並調整與(yu) 其他熒光通道的補償(chang) ，以保證多色分析結果的準確性。由於(yu) 多色分析熒光補償(chang) 的複雜性，許多分析軟件都允許離線補償(chang) ，這為(wei) 操作者提供了極大的便利。

值得注意的是，補償(chang) 與(yu) 特定實驗的特定熒光素組合、特定儀(yi) 器條件設置有關(guan) 。補償(chang) 設置後，如果光電倍增管的電壓、激光器的波長、濾光係統等發生變化，熒光補償(chang) 值就會(hui) 發生變化，需要重新調整補償(chang) 。