免疫熒光染色實驗步驟

免疫熒光染色是常用的生化檢查方法，常用於(yu) 組織學中抗原或抗體(ti) 的定位，也可用於(yu) 體(ti) 液樣本中抗原或抗體(ti) 的定量檢測。很多小夥(huo) 伴在做免疫熒光染色實驗時遇到了各種問題。其實，掌握了免疫熒光染色實驗的原理、操作步驟和注意事項後，順利完成一次免疫熒光染色實驗並不困難。

1.什麽(me) 是免疫熒光技術？
免疫熒光技術（Immunofluence technology）又稱熒光抗體(ti) 技術，主要原理是利用抗原與(yu) 抗體(ti) 之間的特異性結合來展示目標蛋白。免疫熒光技術不僅(jin) 抗原抗體(ti) 反應特異性高，而且在熒光顯微鏡下可以清晰顯示其形態，直觀性強。

免疫熒光染色實驗有兩(liang) 種類型，包括直接免疫熒光和間接免疫熒光。

如何解決(jue) 免疫熒光染色底色過重的問題？詳細講解實驗操作及注意事項

直接免疫熒光是最早的方法。其基本原理是用已知的抗體(ti) 標記熒光素，成為(wei) 特異性熒光抗體(ti) 。染色時，將抗體(ti) 直接滴在載玻片上孵育，使其直接與(yu) 載玻片上的抗原結合，可直接在熒光顯微鏡下檢測。觀察並做出判斷。

間接免疫熒光法的基本原理是利用特異性抗體(ti) 與(yu) 切片中的抗原結合，然後利用間接熒光抗體(ti) 與(yu) 之前的抗原抗體(ti) 複合物結合，形成抗原抗體(ti) 熒光複合物。在熒光顯微鏡下，通過複合物的發光來確定檢測到的抗原。

兩(liang) 種方法的基本原理是相同的。免疫熒光 (IF) 或細胞成像技術使用抗體(ti) 將熒光染料（也稱為(wei) 熒光素或熒光團）（例如異硫氰酸熒光素 (FITC)）標記到特定的目標抗原。與(yu) 熒光素化學綴合的抗體(ti) 廣泛用於(yu) IF 實驗。

直接免疫熒光法簡單、特異、快速、方便，常用於(yu) 腎活檢組織中多種免疫球蛋白的檢測和病原體(ti) 的檢測。但其缺點是隻能檢測一種相應物質，靈敏度較差，有時效果不理想。

間接免疫熒光法由於(yu) 與(yu) 抗原抗體(ti) 複合物結合的熒光素抗體(ti) 增多，熒光亮度強，因此具有較強的靈敏度。因此，間接免疫熒光法更為(wei) 常用，隻需製備一種熒光抗體(ti) ，即可應用於(yu) 多種一抗的標記展示。

2. 免疫熒光染色實驗的操作步驟
免疫熒光染色的操作步驟通常包括：固定和透化、封閉、一抗孵育、洗滌、二抗孵育、重新洗滌和測定讀數。本文以間接免疫熒光為(wei) 例，講解從(cong) 固定到封固各步驟的原理。

1）樣品製備
對於(yu) 貼壁細胞：可以直接使用多孔板，如6孔板、24孔板等來培養(yang) 細胞，然後在預定的時間進行固定等後續操作。也可以使用幹淨的蓋玻片，浸泡在70%乙醇中，用無菌鑷子置於(yu) 6孔板中，然後用無菌鹽水、PBS或培養(yang) 基洗去殘留的乙醇。此時即可接種細胞進行培養(yang) ，待細胞在蓋玻片上生長良好後，即可進行固定等後續操作。

對於(yu) 懸浮細胞：先用固定液固定細胞，然後將細胞滴在載玻片上，幹燥後細胞會(hui) 粘在載玻片上。然後就可以進行後續操作了。如果細胞粘附力較差，可以用PDL等物質處理載玻片，以增強載玻片的粘附力。

對於(yu) 冷凍切片：將切片放置在載玻片上後，可以直接進行固定等後續操作。

對於(yu) 石蠟切片：將切片在二甲苯中脫蠟 5 分鍾，然後用新鮮二甲苯脫蠟，並用共用二甲苯脫蠟 3 次。無水乙醇 5 分鍾，兩(liang) 次。 90%乙醇5分鍾，兩(liang) 次，70%乙醇5分鍾，一次。蒸餾水5分鍾，兩(liang) 次。

抗原修複：根據抗原和抗體(ti) 的不同，可將切片放入以下抗原修複液中，10mM檸檬酸鈉，pH6.0，或1mM EDTA，pH8.0，或10mM Tris，pH10.0，95℃加熱12分鍾，約30分鍾慢慢冷卻至室溫。

2）固定
目標是保留組織的原始結構，維持細胞形態和抗原的細胞分布。當組織細胞死亡時，細胞會(hui) 分解，從(cong) 溶酶體(ti) 和其他細胞器中釋放的酶可以水解組織，這一過程稱為(wei) 自溶。為(wei) 了避免這種情況，有必要固定組織細胞。

細胞或切片可以用適當的固定劑固定，固定後用免疫染色洗滌液 (P0106) 洗滌兩(liang) 次，每次 5 分鍾。常用的固定劑有甲醛、戊二醛、甲醇/丙酮。不同固定劑所需的時間和濃度不同，需要根據具體(ti) 實驗探索。

3）膜破裂
膜破裂，使抗體(ti) 有機會(hui) 遇到抗原。因為(wei) 免疫染色的基本原理是抗原和抗體(ti) 結合，然後標記的抗體(ti) 發出熒光，從(cong) 而可以對目標蛋白進行定性或定量分析。如果待檢測的抗原位於(yu) 細胞膜或細胞外基質的外表麵，則可以省略透化步驟。因為(wei) 抗體(ti) 也可以有機會(hui) 與(yu) 抗原結合而不破膜。然而，如果要檢測的抗原位於(yu) 細胞內(nei) ，則需要打破細胞膜，並將細胞暴露於(yu) 針對目標蛋白質的一抗，以確保抗體(ti) 能夠接近表位。常用的破膜劑有Triton X-100、NP-40、Brij-58、皂苷、洋地黃皂苷、甲醇/丙酮。再次，破膜劑的選擇應根據具體(ti) 實驗進行。

4) 封閉
封閉是最小化一抗非特異性結合的重要步驟。在使用特異性一抗與(yu) 目的蛋白結合的過程中，如果出現非特異性結合，可能會(hui) 出現假陽性結果，而且背景染色過強也會(hui) 幹擾目的染色的呈現，影響對結果的判斷。實驗結果。理論上，任何不結合靶抗原的蛋白質都可以用於(yu) 封閉。血清是一種常見的封閉劑，因為(wei) 它含有與(yu) 非特異性位點結合的抗體(ti) 。使用血清或蛋白封閉劑進行封閉可防止抗體(ti) 與(yu) 組織或 Fc 受體(ti) 的非特異性結合。

從(cong) 封閉開始的所有步驟，必須注意樣品的保濕，避免樣品幹燥，否則容易產(chan) 生高背景。

5) 一抗孵育
預選的特異性一抗可以與(yu) 目的蛋白結合。這一步需要注意一抗是針對什麽(me) 物種的。如果組織細胞來源是小鼠，一抗應該是某種動物抗小鼠，其中某種動物是指一抗宿主，例如一抗是山羊抗小鼠，山羊就是一抗抗體(ti) 宿主。

6）二抗孵育一
抗孵育後，將未結合的一抗洗掉，即可進行一抗與(yu) 二抗的結合。二抗應該是針對一抗宿主物種的熒光標記二抗。例如，一抗是山羊抗小鼠，二抗應該是某種動物抗山羊，例如兔抗山羊。

如果進行雙染，要注意一抗和二抗宿主的選擇，以免出現交叉結合的可能。例如，如果組織來源是小鼠，並且需要檢測兩(liang) 種目標蛋白，則一抗宿主應不同，二抗應具有不同的熒光標記。針對目標蛋白A的一抗可以是山羊抗小鼠，針對目標蛋白B的一抗可以是大鼠抗小鼠（大鼠和山羊是不同的一抗宿主），針對A的二抗是具有綠色熒光的兔抗體(ti) 山羊二抗、B二抗是兔抗大鼠二抗，有紅色熒光，這種組合是可以的。在熒光顯微鏡下，目標蛋白A被染成綠色，目標蛋白B被染成紅色。但如果B一抗也是羊抗鼠的話，A二抗也會(hui) 和B一抗結合，這時候就亂(luan) 了，熒光鏡下是綠色的。

7）蓋玻片
封片是指免疫染色後使用封片劑將蓋玻片粘附到組織切片或細胞塗片上。蓋玻片可保護染色樣本免受物理損壞。進行蓋玻片的封片劑也有助於(yu) 提高顯微鏡下圖像的清晰度和對比度。

8) 蛋白質的檢測
對於(yu) 免疫熒光染色，此時已經可以直接在熒光顯微鏡下觀察。

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3. 三種細胞免疫熒光染色實驗舉(ju) 例
zo-1 的免疫熒光
1) 當細胞在蓋玻片上生長至95%-100%匯合時從(cong) 培養(yang) 箱中取出。
2) 用預熱的 1×PBS 洗滌 3 次，每次 10 分鍾
3) 4% 甲醛室溫固定 20-30 分鍾
4) 用 1×PBS 洗滌 3 次，每次 10 分鍾
5) 透化0.2% Triton X-100 2-5 分鍾
6) 用 1×PBS 清洗 3 次，每次 10 分鍾
7) 用 5% BSA 室溫封閉 30 分鍾
8) 添加一抗（用 1% BSA 稀釋）放入潮濕盒中，4度過夜
9) 用1×PBS清洗3次，每次10分鍾
10）加入二抗（1%BSA稀釋）30分鍾，關(guan) 燈！ !!
11) 用 1×PBS 清洗 3 次，每次 10 分鍾
12) 用 95% 甘油封片
注：4% 甲醛、0.2% Triton、5% BSA 均用 1×PBS 稀釋"

細胞載玻片的免疫熒光
1)取出細胞載玻片放入35mm或60mm用過的培養(yang) 皿中，用PBS洗滌3次。
有時製作的細胞玻片可能比較小，所以挑取時要小心，注意反麵，放在培養(yang) 皿中清洗比較方便，避免來回剪切，清洗時加PBS，不要洗太多，不要衝(chong) 洗細胞。洗的時候我總是多加一些PBS，稍微搖晃一下就倒掉，不用等5分鍾或者10分鍾。
2) 4%冷多聚甲醛固定20分鍾，PBS洗滌3次。
3) 用0.2% Triton X-100 透化10 分鍾，用PBS 洗滌3 次。
4)與(yu) 二抗相同宿主的血清封閉30分鍾，PBS洗滌3次。
5) 一抗可在濕化盒中4度保存過夜，或37度保存2小時。感覺前者有效。用 PBS 清洗 3 次。
6）二抗室溫放置2小時（避光），或37度1個(ge) 半小時，PBS洗3次。
7）最好用DAPI對細胞核進行染色，然後直接拍攝熒光膠片。
8) 用蒸餾水洗掉PBS，用甘油封膜，並用指甲油封膜周圍。因為(wei) 甘油不像樹脂那樣幹燥，如果不用指甲油密封的話就會(hui) 亂(luan) 七八糟。

細胞免疫熒光簡單實驗
1）將血清蛋白H7.2-7.4在37度PBS中衝(chong) 洗2小時。
2) -20度甲醇固定20分鍾後，自然幹燥10分鍾
3) PBS清洗：3min*3
4) 1% Triton：25min-30min。配成50ultriton+5ml pBS
5) PBS洗：2*5min
6) 羊血清封閉：37度，20分鍾
7) 一抗，4度過夜，一般18小時以上或37度1-2小時
8) 4度PBS洗，3min*5次
9）二抗37度不到一小時
10）37度PBS洗，幹燥3*5min，密封（封閉液PH8.5）

無論采用何種方法，用PBS緩衝(chong) 液漂洗時，必須漂洗幹淨，並測量pH值。可以用PBS清洗幾次，也可以延長PBS清洗時間。如果結果背景較高，可以延長漂洗次數。和時間。

如何解決(jue) 免疫熒光染色底色過重的問題？詳細講解實驗操作及注意事項
四、免疫熒光染色注意事項
1）熒光試劑應妥善保管

盡管許多熒光團相對光穩定，但在儲(chu) 存和染色過程中未能避光可能會(hui) 導致熒光團-抗體(ti) 綴合物降解，從(cong) 而導致假陰性結果。因此，熒光物質必須在建議的溫度下小心儲(chu) 存，並始終避光，以保護其光譜完整性。

2) 仔細選擇熒光 免疫熒光
技術的一個(ge) 主要優(you) 點是它提供了多重檢測的機會(hui) ，如今流式細胞術可以測量每個(ge) 細胞 20 多個(ge) 離散參數。在設計多重實驗時，應考慮每種熒光團的性質，例如吸收和發射最大波長、消光係數和斯托克斯位移。

3）適當的對照是必要的
任何實驗數據的分析都依賴於(yu) 相關(guan) 的對照，免疫熒光染色也不例外。每次檢測需設置以下三個(ge) 對照：
(1) 陽性對照：陽性血清+熒光標記
(2) 陰性對照：陰性血清+熒光標記
(3) 熒光標記對照：PBS+熒光標記

5、免疫熒光實驗常見問題排查指南
1）背景染色太強
背景染色太強，意味著除了我們(men) 希望看到的特異染色在前景中起主導作用外，還有一幫吃瓜群眾(zhong) （與(yu) 我們(men) 想要看到的特定染色相同的顏色）在後麵。

到底是什麽(me) 原因導致這些演員搶了主角的戲呢？可能的原因如下。

組織切片太厚：這種情況，可以選擇將組織切片變薄。

封閉不良：封閉的目的是減少非特異性結合，減少背景染色。如果背景太強，考慮更換封閉液或增加封閉孵育時間

二抗具有非特異性結合：要驗證是否存在這種情況，可以製作空白對照，隻在染色過程中添加二抗（也就是說一抗不要使用特異性一抗）孵育過程，例如使用一抗稀釋液進行孵育一抗的步驟）。如果空白對照被染色，則表明二抗具有非特異性結合。此時，建議更換二抗。

自發熒光：要了解組織是否具有自發熒光，請在非染色區域尋找熒光。一些自發熒光來自固定步驟，可以避免戊二醛固定或用 PBS 中的 0.1% 硼氫hua鈉清洗以去除遊離醛基。還有一些來自內(nei) 源性熒光分子的熒光，可以用蘇丹黑/硫酸銅進行光漂白。

抗體(ti) 濃度過高：降低所用抗體(ti) 濃度或調整孵育時間。

洗滌不充分：染色的步驟較多，而洗滌的步驟也較多。實驗過程中要確保洗滌到位，不要偷工減料。

2）染色弱或無染色
可能的原因有：您要研究的目的蛋白在組織本身中不存在或表達量很小。

如果懷疑目的蛋白不存在，可以通過WB等多種方法進行驗證。由於(yu) 不同蛋白質探索實驗的原理和操作不同，結果可能會(hui) 有所不同，多次實驗的驗證更容易避免假陰性。如果感興(xing) 趣的蛋白質表達量較小，則可以考慮采取額外的步驟來放大熒光信號。

熒光顯微鏡的問題。

如果熒光顯微鏡的參數設置不正確，可能看不到熒光。例如，光源/濾光裝置與(yu) 您想要檢測的熒光不匹配。每次拍照時，記得檢查參數是否正確。

曝光時間太短或光吸收太低（增益值太低）：您可以嚐試增加增益值和/或增加曝光時間以找到最佳值。

曝光時間過長，發生熒光猝滅：避免切片過度曝光。使用後立即將切片存放在黑暗中。

細胞/組織的過度固定：因為(wei) 過度固定會(hui) 使表位被遮蔽，使抗體(ti) 無法與(yu) 抗原結合，所以當然沒有熒光。所以可以盡量減少固定時間，也可以嚐試做抗原修複來揭示抗原表位。

組織/細胞幹燥：確保切片在整個(ge) 染色過程中保持濕潤。

如果細胞沒有透化，一抗就無法進入：例如，如果你要研究的目標蛋白在細胞內(nei) ，但由於(yu) 沒有鑽石，抗體(ti) 無法進入細胞並與(yu) 目標蛋白待在一起，那麽(me) 你當然看不到它們(men) 。愛的火花。所以，我們(men) 可以想辦法讓細胞打開綠色通道，架起喜鵲之橋。例如，如果使用甲醛固定組織細胞，則可以使用 0.2% Triton X-100 對細胞進行透化（濃度可能因實驗而異）。對於(yu) 用甲醇或丙酮固定的組織細胞，不需要 Triton X-100，因為(wei) 前者可以透化細胞。

一抗用量不足/孵育時間太短：增加抗體(ti) 濃度或延長孵育時間

一抗不適合：在購買(mai) 一抗之前，記得閱讀產(chan) 品信息，並不是所有的一抗都可以用於(yu) 免疫熒光染色實驗。另外，請確保產(chan) 品尚未過期。

一抗和二抗不兼容：例如，如果您的組織來源是小鼠，那麽(me) 一抗應該是某種動物抗小鼠，例如山羊抗小鼠，那麽(me) 二抗應該是某種動物抗體(ti) 山羊，如兔抗羊。也就是說，二抗應該針對一抗宿主。

切片保存時間過長：樣本染色後應盡快觀察拍照，否則信號會(hui) 隨著時間的推移而減弱。考慮將切片盡可能長時間地保存在 4⁰C 避光條件下。

抗體(ti) 儲(chu) 存問題：避免反複冷凍和解凍抗體(ti) ，因為(wei) 這可能會(hui) 導致抗體(ti) 降解。建議購買(mai) 抗體(ti) 後，根據每次實驗的需要，將抗體(ti) 分成幾小份保存，以便每次使用一小管。另外，存放前記得閱讀使用說明書(shu) ，並按照使用說明書(shu) 的說明進行存放。比如具體(ti) 的儲(chu) 存溫度、是否避光等。