熒光顯微鏡的工作原理

熒光顯微鏡：熒光顯微鏡是利用紫外光作為(wei) 光源照射被檢物體(ti) ，使其發出熒光，然後在顯微鏡下觀察物體(ti) 的形狀和位置。

熒光顯微鏡用於(yu) 研究細胞內(nei) 化學物質的吸收、運輸、分布和定位。細胞內(nei) 的某些物質，如葉綠素，受紫外線照射後能發出熒光；有些物質本身不能發出熒光，但如果用熒光染料或熒光抗體(ti) 染色，在紫外線照射下也能發出熒光。對此類物質進行定性和定量研究的工具之一。

確認

熒光顯微鏡與(yu) 普通顯微鏡有以下區別：
1、照明方式通常為(wei) 落射照明，即光源通過物鏡投射到樣品上；
2、有兩(liang) 片特殊濾光片，光源前麵的一片用於(yu) 濾除可見光，目鏡與(yu) 物鏡之間的一片用於(yu) 濾除紫外線，保護人眼。
熒光顯微鏡也是光學顯微鏡的一種，主要區別在於(yu) 兩(liang) 者的激發波長不同。這就決(jue) 定了熒光顯微鏡與(yu) 普通光學顯微鏡在結構和用途上的差異。
熒光顯微鏡是免疫熒光細胞化學的重要工具。它由光源、濾光板係統和光學係統等主要部件組成。它是利用一定波長的光激發標本發射熒光，通過物鏡和目鏡係統放大觀察標本的熒光圖像。

工作準則

光源
多采用200W超高壓汞燈作為(wei) 光源。它由石英玻璃製成，中間呈球形，裏麵充有一定量的水銀。工作時，兩(liang) 個(ge) 電極之間放電使汞蒸發，球內(nei) 壓力迅速升高。當汞全蒸發時，可達到50至70個(ge) 標準大氣壓，這個(ge) 過程一般需要5至15分鍾左右。超高壓汞燈的發光是電極間放電使汞分子不斷解離還原時發射光量子的結果。它發出強烈的紫外線和藍紫色光，足以激發各種熒光物質，因此常用於(yu) 熒光顯微鏡。
超高壓汞燈也會(hui) 釋放大量的熱能。因此，燈室必須具有良好的散熱條件，工作環境溫度不宜過高。
新型超高壓汞燈在使用初期無需高壓即可點燃。使用一段時間後，需要用高壓（15000V左右）啟動。啟動後，維持工作電壓一般為(wei) 50-60V，工作電流為(wei) 4A左右。 200W超高壓汞燈每次使用2小時，平均壽命約為(wei) 200小時。因此，使用時盡量減少啟動次數。燈泡在使用過程中，其光效逐漸降低。燈熄滅後，等待其冷卻後再重新啟動。點亮後不要立即關(guan) 閉燈泡，以免汞蒸發不全而損壞電極，一般需要等待15min。由於(yu) 超高壓汞燈壓力高，紫外線強，燈泡必須放入燈室內(nei) 才能點燃，以免傷(shang) 眼和爆炸。
超高壓汞燈（100W或200W）的光源電路包括變壓、鎮流器、啟動等幾部分。燈箱上有調節燈泡發光中心的係統，燈泡燈泡後麵安裝有鍍鋁凹麵反射鏡，前麵安裝有聚光透鏡。

濾色鏡係統
濾色鏡係統是熒光顯微鏡的重要組成部分，由激發濾光板和壓濾光板組成。濾板的型號、各廠家的名稱往往不統一。濾光板一般以基本色調來命名，前麵的字母代表色調，後麵的字母代表玻璃，數字代表型號特征。例如德國產(chan) 品（肖特）BG12是一種藍色玻璃，B是藍色的第一個(ge) 字母，G是玻璃的第一個(ge) 字母；有一些廠家的濾板全用數字命名，如美國康寧廠的濾板。 NO：5-58，相當於(yu) BG12。

1.激發濾光板根據光源和熒光顏料的特性，可以選擇以下三種類型的激發濾光板，以提供一定波長範圍內(nei) 的激發光。
紫外光激發濾光片：該濾光片可透過400nm以下的紫外光，阻擋400nm以上的可見光通過。常用的型號有UG-1或UG-5，再加一個(ge) BG-38來消除紅色尾流。
紫外藍光激發濾光板：該濾光板可以通過300-450nm範圍內(nei) 的光。常用型號有ZB-2或ZB-3，加上BG-38。
紫藍色激發濾光片：可通過350～490nm的光。常用型號為(wei) QB24（BG12）。
最大吸收峰在500nm以上的熒光素（如羅丹明色素）可以被藍綠色濾光板（如B-7）激發。
使用金屬膜幹涉濾光片。由於(yu) 其針對性強、波長合適，激發效果比玻璃濾光片更好。例如西德Leitz工廠的FITC專(zhuan) 用KP490濾板和羅丹明的S546綠色濾板都遠遠優(you) 於(yu) 玻璃濾板。
激勵濾光片分為(wei) 薄型和厚型兩(liang) 種。一般暗視野使用較薄的濾光板，明視場熒光顯微鏡可使用較厚的濾光板。基本要求是獲得最亮的熒光和好的背景。

2、壓製濾光板 壓製濾光板的作用是全阻擋激發光的通過，並提供相應波長範圍內(nei) 的熒光。與(yu) 激發濾光板相對應，常用的有以下三種壓製濾光板：
紫外光壓製濾光板：可透過可見光，阻擋紫外線透過。可與(yu) UG-1 或 UG-5 結合使用。常用GG-3K430或GG-6K460。
紫藍壓濾板：可通過波長510nm以上（綠至紅）的光，可與(yu) BG-12組合使用。通常使用OG-4K510或OG-1K530。
紫外壓製濾光板：可透過波長460nm以上（藍到紅）的光，可與(yu) BG-3組合，常用OG-11K470AK 490、K510。

反光罩
反光罩的反射層一般采用鍍鋁，因為(wei) 鋁在紫外光和可見光的藍紫光區吸收較少，反射率在90%以上，而銀的反射率隻有70%；一般采用平麵反射器。

專(zhuan)
為(wei) 熒光顯微鏡設計的聚光鏡由石英玻璃或其他傳(chuan) 輸紫外線的玻璃製成。有光場聚光鏡和暗場聚光鏡兩(liang) 種。還有相襯熒光聚光器。
1. 明場聚光鏡 明場聚光鏡常用於(yu) 一般熒光顯微鏡。聚光能力強，使用方便。特別適合低倍和中倍放大標本的觀察。
2. 暗視野聚光鏡 暗視野聚光鏡越來越多地用於(yu) 熒光顯微鏡。因為(wei) 激發光不直接進入物鏡，除了散射光外，激發光不進入目鏡。可以使用薄的激發濾光片來增強激發光的強度，並且壓濾光片也可以很薄。無色濾光片（無紫外線透射），同時仍產(chan) 生深色背景。從(cong) 而增強了熒光圖像的亮度和對比度，提高了圖像質量，觀察舒適，並且可以發現明場中難以區分的細小熒光顆粒。
3、相襯熒光聚光鏡 相襯聚光鏡與(yu) 相襯物鏡配合使用，可以同時進行相襯和熒光相結合的觀察，既可以看到熒光圖像，又可以看到相襯圖像。有助於(yu) 熒光的準確定位。一般熒光觀察很少需要這種聚光鏡。

物鏡
可以使用多種物鏡，但優(you) 選消色差物鏡，因為(wei) 它的自發熒光最小，並且其透射率（波長範圍）適合熒光。由於(yu) 顯微鏡視場內(nei) 圖像的熒光亮度與(yu) 物鏡孔徑比的平方成正比，與(yu) 其放大倍數成反比，因此為(wei) 了提高熒光圖像的亮度，需要采用大孔徑的物鏡。應使用孔徑比。尤其是在高倍放大下，其效果非常明顯。因此，對於(yu) 熒光不足的標本，應使用大孔徑比的物鏡，目鏡盡可能低（4×、5×、6.3×等）。

目鏡
在熒光顯微鏡中使用低倍目鏡，例如 5× 和 6.3×。過去經常使用單目目鏡，因為(wei) 其亮度是雙目目鏡的兩(liang) 倍以上，但研究型熒光顯微鏡大多使用雙目目鏡，觀察非常方便。
落射光裝置
新型落射光器件是光源發出的光照射到幹涉分光濾光片後，由於(yu) 濾光片上塗層的性質，短波長部分（紫外線和紫藍色）被反射。當濾光片麵向光源時，為(wei) 45度。傾(qing) 斜時垂直射向物鏡，然後通過物鏡射向標本，使標本受到激發，物鏡直接起聚光作用。同時，濾光片的長部分（綠色、黃色、紅色等）對於(yu) 濾光片來說是透明的。因此，它不會(hui) 反射向物鏡，並且濾光片充當激發濾光片。由於(yu) 標本的熒光處於(yu) 可見光波長範圍內(nei) ，可以通過濾光片到達目鏡進行觀察，熒光圖像的亮度隨著放大倍數的增加而增加，並且在高放大倍數下比透射光源更強。除具有透射光源的功能外，更適合直接觀察不透明和半透明標本，如厚片、濾光片、菌落、組織培養(yang) 標本等。研製的新型熒光顯微鏡大多采用落射光器件，稱為(wei) 落射熒光顯微鏡。研製的新型熒光顯微鏡大多采用落射光器件，稱為(wei) 落射熒光顯微鏡。研製的新型熒光顯微鏡大多采用落射光器件，稱為(wei) 落射熒光顯微鏡。

CCD

簡介
熒光顯微鏡CCD是與(yu) 熒光顯微鏡密切相關(guan) 的數碼相機產(chan) 品。一方麵可以將熒光顯微鏡拍攝的顯微攝影產(chan) 物通過USB接口傳(chuan) 輸至計算機，方便圖像采集和研究。另一方麵，通過熒光顯微鏡CCD我們(men) 可以比單獨使用熒光顯微鏡拍攝更好的照片。熒光顯微鏡CCD可與(yu) 熒光顯微鏡連接構成顯微成像係統。

使用範圍
一般情況下，單獨使用熒光顯微鏡就可以達到理想的成像效果，但在某些情況下，比如當熒光比較弱時，單獨使用熒光顯微鏡無法達到理想的拍攝效果，或者我們(men) 希望您可以上傳(chuan) 拍攝的照片熒光圖像傳(chuan) 輸至計算機，用於(yu) 預覽、修改甚至發表學術論文。這時如果沒有熒光顯微鏡CCD就無法滿足要求。

特點
熒光顯微鏡CCD一般具有良好的弱光捕獲能力，可以捕獲極弱的熒光，因此成像能力良好。另外，不少熒光冷CCD生產(chan) 公司都對CCD進行了這樣的製冷處理，使得該類CCD的噪聲大大增加。減少，信噪比可以大大提高。由於(yu) 其方便的應用效果，此類CCD相機廣泛應用於(yu) 熒光顯微鏡中。

標本製備要求

熒光顯微鏡的標本製備要求
1. 載玻片
載玻片的厚度應在 0.8 至 1.2 毫米之間。一方麵，如果坡度太厚，會(hui) 吸收更多的光，另一方麵，激發光不能集中在標本上。載玻片必須光滑、厚度均勻且無明顯自發熒光。有時使用石英玻璃載玻片。

2、蓋玻片
蓋玻片厚度約為(wei) 0.17mm，光滑、潔淨。為(wei) 了加強激發光，還可以使用幹涉蓋玻片，它是一種特殊的蓋玻片，上麵鍍有幾層物質（如氟化鎂），這些物質對不同波長的光有不同的幹涉效果。平滑地通過，同時反射激發光，該反射的激發光可以激發樣本。

3、標本
組織切片或其他標本不宜太厚，太厚則大部分激發光消耗在標本下部，物鏡直接觀察的上部激發不夠充分。另外，細胞的重疊或雜質的掩蔽也會(hui) 影響判斷。

4.封固劑
甘油是常用的封固劑。它必須是無色透明且無自發熒光的。 pH值8.5~9.5時熒光亮度較亮，且不易快速消失。

5、鏡油
一般用暗場熒光顯微鏡和油鏡觀察標本時，必須使用鏡油。最好使用專(zhuan) 用的非熒光鏡片油。也可以使用上述的甘油來代替。也可以使用液體(ti) 石蠟，但折射率較低，圖像質量略有影響。影響。

指示

(1)打開光源，超高壓汞燈需要預熱15分鍾才能達到最亮點。
(2)對於(yu) 透射型熒光顯微鏡，應在光源和暗場聚光鏡之間安裝所需的激發濾光片，並在物鏡後麵安裝相應的壓濾光片。對於(yu) 落射熒光顯微鏡，需要將所需的激發濾光片、二色分束器和壓濾光片插入件插入光路中的槽中。
(3)用低倍鏡觀察，根據不同型號熒光顯微鏡的調節裝置調節光源中心，使其位於(yu) 整個(ge) 照明光斑的中心。
(4) 放置標本片，調焦後觀察。使用時應注意：未安裝濾光片時請勿用眼睛直接觀察，以免造成眼睛損傷(shang) ；用油鏡觀察標本時，必須使用無熒光的專(zhuan) 用鏡油；高壓汞燈關(guan) 閉後，不能立即再次打開，需要等待。水銀燈必須全冷卻後才能重新啟動，否則會(hui) 不穩定，影響水銀燈的壽命。
(5)觀察。例如，在熒光顯微鏡下使用藍紫色濾光片，觀察用0.01%吖啶橙熒光染料染色的細胞，細胞核和細胞質被激發產(chan) 生兩(liang) 種不同顏色的熒光（深綠色和橙紅色）。

防範措施

(1)嚴(yan) 格按照熒光顯微鏡出廠說明書(shu) 的要求進行操作，不得隨意改變程序。
(2)檢查應在暗室中進行。進入暗室後，接通電源，點亮超高壓汞燈5-15分鍾。光源發出的強光穩定後，眼睛全適應暗室，然後開始觀察標本。
(3)為(wei) 防止紫外線對眼睛的傷(shang) 害，調節光源時應戴防護眼鏡。
(4)檢查時間每次以1～2小時為(wei) 宜。如果超過90分鍾，超高壓汞燈的發光強度會(hui) 逐漸下降，熒光也會(hui) 減弱；標本經紫外線照射3～5分鍾後，熒光也會(hui) 明顯減弱；因此，不應超過2至3小時。
(5)熒光顯微鏡光源的壽命有限，應集中檢查標本，以節省時間並保護光源。天氣炎熱時，應加風扇降溫，並從(cong) 更換新燈泡時開始記錄使用時間。燈泡熄滅後想再次使用時，必須等燈泡冷卻後再點亮。應避免每天多次點亮光源。
(6) 染色後立即觀察標本，隨著時間的推移熒光會(hui) 逐漸減弱。如果將標本保存在4℃的聚乙烯塑料袋中，可以延遲熒光減弱時間，並可以防止封片劑蒸發。激發光長期照射標本會(hui) 引起熒光衰減和消失，因此應盡量縮短照射時間。暫時不觀察時可用遮光罩遮擋激發光。
(7)觀察標本時應使用非熒光油，並避免眼睛直視紫外光源。
(8)電源應配備穩壓器，電壓不穩定會(hui) 降低日光燈的壽命。

熒光顯微鏡與(yu) 普通顯微鏡有以下區別：
1、照明方式通常為(wei) 落射照明，即光源通過物鏡投射到樣品上；
2、光源為(wei) 紫外光，波長較短，分辨率比普通顯微鏡高；
3、有兩(liang) 片特殊濾光片，光源前麵的一片用於(yu) 濾除可見光，目鏡與(yu) 物鏡之間的一片用於(yu) 濾除紫外線，保護人眼。
熒光顯微鏡也是光學顯微鏡的一種，主要區別在於(yu) 兩(liang) 者的激發波長不同。這就決(jue) 定了熒光顯微鏡與(yu) 普通光學顯微鏡在結構和用途上的差異。
熒光顯微鏡是免疫熒光細胞化學的重要工具。它由光源、濾光板係統和光學係統等主要部件組成。它是利用一定波長的光激發標本發射熒光，通過物鏡和目鏡係統放大觀察標本的熒光圖像。